程健恒, 陳謀通, 陳月桃,2, 張菊梅, 吳清平,*

(1.廣東省微生物研究所/省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室/廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室,廣東廣州 510070;2.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642)

單核細胞增生李斯特菌(Listeria monoocytogens,LM),是一種革蘭氏陽性兼性厭氧食源性致病菌,被世界衛(wèi)生組織列為四大食源性致病菌之一。LM可感染人畜發(fā)病,可導致腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)和腸胃炎等嚴重李斯特菌病,致死率為20% ～30%,易感人群為老人、孕婦、新生兒及免疫力低下的人群。

喹諾酮類藥物是指含有4-喹諾酮類母核的合成抗菌藥物,是現(xiàn)今臨床治療細菌感染性疾病的重要藥物。盡管喹諾酮類藥物未列為臨床治療李斯特菌病的一線抗生素,但是由于此類藥物在臨床上使用的頻率越來越高,間接上導致了耐受喹諾酮類LM的出現(xiàn)[1]。第三代喹諾酮類藥物具有良好的組織滲透性、抗菌活性強、不良反應(yīng)少,被廣泛應(yīng)用于人醫(yī)、獸醫(yī)和漁業(yè)等方面,常用品種有左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星等。國內(nèi)外研究表明,LM對喹諾酮類抗生素的耐藥情況較為嚴重[2-5]。

前期研究表明,細菌對喹諾酮類耐藥的機制主要有3種：1)由于編碼促旋酶(gyrA和gyrB編碼)或撲拓異構(gòu)酶Ⅳ(parC和parE)基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance-determining region,QRDR)發(fā)生突變,導致氨基酸置換,使得抗生素不能與靶酶結(jié)合而耐藥[6]。在革蘭氏陰性菌中,促旋酶比撲拓異構(gòu)酶更敏感,因此革蘭氏陰性菌耐喹諾酮類菌株一般在gyrA和gyrB的位點上發(fā)生突變(主要在gyrA上);但在革蘭氏陽性菌中,撲拓異構(gòu)酶Ⅳ通常是喹諾酮類抗生素的首要目標,因此,革蘭氏陽性菌的喹諾酮類耐藥突變首先在parC上發(fā)生[7]。2)喹諾酮類耐藥機制是通過改變膜的通透性或通過外排泵作用降低細胞內(nèi)抗生素濃度,從而造成喹諾酮類抗生素耐藥[7-9]。目前研究發(fā)現(xiàn),LM有兩個外排泵基因與耐藥性相關(guān),其中一個是mdrL,能泵出大環(huán)內(nèi)酯類、頭孢噻肟類等抗生素。通常情況下,喹諾酮類抗生素也能被MDR系統(tǒng)泵出,但由于底物特異性較低,當MDR系統(tǒng)過度表達時,會賦予細菌低水平的喹諾酮類耐藥[7]。另一個外排泵基因lde,它對LM產(chǎn)生喹諾酮耐藥發(fā)揮著重要作用[1]。3)由質(zhì)粒介導的(plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)喹諾酮類耐藥。PMQR基因通常位于移動質(zhì)粒上,并可通過水平基因轉(zhuǎn)移過程中在細菌細胞間傳播。目前發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒介導喹諾酮類耐藥基因有3種,分別是qnr,aac(6')-lb-cr以及質(zhì)粒介導的外排泵基因qepA和oqxAB[10]。

本研究對全國代表性地區(qū)分離的945株食源性LM進行喹諾酮類抗生素敏感性分析,研究32株耐受喹諾酮類抗生素的分離菌株攜帶耐藥基因、外排泵和耐藥質(zhì)粒的情況,并在此基礎(chǔ)上進行遺傳多樣性分析,旨在探討LM耐受喹諾酮類抗生素的潛在分子機制,為預防和控制LM提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株及來源

自2012年7月至2016年7月,本實驗室從全國43個代表性城市或地區(qū)共分離篩選出食源性單增李斯特菌945株,用終濃度為15%的甘油管保藏于-40℃冰箱中備用。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

李斯特菌顯色培養(yǎng)基、腦心浸出液培養(yǎng)基等培養(yǎng)基、一次性接種環(huán),廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;鹽酸環(huán)丙沙星,中國食品藥品檢定研究院技術(shù)服務(wù)部標準品;利血平,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;PrimeSTAR?HSDNA Polymerase,寶生物工程(大連)有限公司;2×DreamTaq Green PCR Master Mix,Thermo Fisher Scientific公司;Trans2K DNA marker,北京全式金生物技術(shù)有限公司;GoldView?核酸染料,北京索萊寶(Solarbio)公司;細菌基因組DNA提取試劑盒,廣州美基生物科技有限公司;電泳級瓊脂糖,西班牙Biowest公司;抗生素藥敏紙片,英國Oxoid公司;96孔板,美國康寧公司;PCR引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.1.3 儀器與設(shè)備

DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱、HK-C2S型單人雙面垂直潔凈工作臺,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;ZEALWAY GI-54TW型高壓滅菌鍋,美國致微儀器股份有限公司;EPOCH2型微孔板分光光度計,美國伯騰儀器有限公司;BiometraTone 96G型PCR儀,德國耶拿分析儀器股份公司;Tanon2500型凝膠成像系統(tǒng),上海天能科技有限公司;LightCycler 96型熒光定量PCR儀,美國羅氏(Roche)公司;游標卡尺,廣西桂林廣陸數(shù)顯儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗生素敏感性分析

由于目前美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)指南中尚未制定李斯特菌抗生素敏感測試的參考標準,因此采用CLSI 2017年版(M100-S27)的葡萄球菌屬臨界值判斷標準作為參考(表1),采用KB法對本實驗室保存的945株食源性單核細胞增生李斯特菌進行喹諾酮類抗生素敏感性分析。金黃色葡萄球菌ATCC 25923和大腸桿菌 ATCC 25922作為藥敏紙片質(zhì)量控制菌株。采用游標卡尺測定抑菌圈大小,精確至0.01 mm。篩選出的喹諾酮類耐藥的單增李斯特菌用于后續(xù)實驗。

1.2.2 最小抑菌濃度實驗

利用去離子水配制質(zhì)量濃度為256μg/mL的環(huán)丙沙星母液,并用針筒過濾器(孔徑0.22μm)過濾后放置于-20℃冰箱備用。實驗用菌株37℃過夜培養(yǎng)后,利用BHI無菌液體培養(yǎng)基稀釋制備濃度為105CFU/mL的初始菌液。首先在96孔板加入100 μL無菌BHI培養(yǎng)基,吸取100μL環(huán)丙沙星母液在96孔板上,使用二倍稀釋法進行稀釋。每孔接種100μL的初始菌液,環(huán)丙沙星終質(zhì)量濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0 μg/mL,Parafilm 封口膜封板后于 37 ℃培養(yǎng)18 h,使用EPOCH2微孔板分光光度計讀取每個孔的OD595吸光值。根據(jù)OD595吸光值判定,培養(yǎng)基中未見菌株生長的環(huán)丙沙星最低濃度值即為最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration,MIC)值。

表1 喹諾酮類抗生素藥敏判斷標準Tab.1 Criterion of quinolone resistance in Listeria monocytogenes

1.2.3 PCR擴增QRDR和PMQR基因

按照細菌基因組提取試劑盒的操作步驟提取LM的基因組作為擴增模版,其中QRDR相關(guān)基因gyrA、gyrB,parC、parE、fepR 的擴增引物和反應(yīng)條件如表2。PCR體系為50μL,包含5×Prime STAR buffer(Mg2+Plus)10μL,dNTP mixture(4 mmol/L)4μL,正向引物與反向引物各0.3μmol/L,2μL基因組以及1.25 UTaq DNA聚合酶。擴增條件為：94℃預變性5 min,94℃變性30 s,退火1 min,72℃延伸1 min,35個循環(huán)后,72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后,使用DNAMAN軟件對其序列進行拼接。以單增李斯特菌標準菌株EGDe基因組序列作為參考序列,利用Mega 7.0軟件對QRDR基因的測序序列進行BLAST比對分析,以確定其QRDR基因突變情況。

PMQR 相關(guān)基因 qnrA、qnrB、qnrD、qnrS的擴增引物與反應(yīng)條件如表3。擴增體系為20μL,包含10μL 2×Dream Taq Green PCR Master Mix,正向引物與反向引物各0.3μmol/L以及2μL基因組DNA。擴增條件為94℃預變性5 min,94℃變性30 s,退火1 min,72℃延伸1 min,30個循環(huán)后,72℃延伸10 min。產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠(含0.005%goldview staining)電泳進行分離(100 V,40 min),利用Tanon 2500UV照相系統(tǒng)拍照并保存為TIFF格式。

表2 LM的QRDR相關(guān)基因引物Tab.2 Primers of QRDR genes in Listeria monocytogenes

表3 LM的PMQR相關(guān)基因引物Tab.3 Primers of PMQR genes in Listeria monocytogenes

1.2.4 外排泵lde檢測及抑制實驗

對32株喹諾酮類抗生素耐藥的單增李斯特菌的基因組進行PCR擴增,檢測外排泵基因lde,引物由本研究設(shè)計(ldeF：5′-ATAGGCTGGGTAAGTGCTGCTGC-3′,ldeR： 5′-ATTTGCGTCGTCTAAACTCTCAGGC-3′)。 擴增體系為 20μL,包含 10μL 2×Dream Taq Green PCR Master Mix,正向引物與反向引物各0.3μmol/L以及2μL基因組DNA。擴增條件為94℃預變性5 min,94℃變性30 s,60℃退火1 min,72℃延伸1 min,30個循環(huán)后,72℃延伸10 min。產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠(含0.005%goldview staining)電泳進行分離(100 V,40 min),利用Tanon 2500UV照相系統(tǒng)拍照并保存為TIFF格式。

利用三氯甲烷溶解利血平后再加入無水乙醇制備終質(zhì)量濃度20 mg/mL的利血平母液,利用去離子水配制質(zhì)量濃度為256μg/mL的環(huán)丙沙星母液。兩種溶液用針筒過濾器(孔徑0.22μm)過濾后放置于-20℃冰箱備用。實驗用菌株37℃過夜培養(yǎng)后,利用BHI無菌液體培養(yǎng)基稀釋制備濃度為105CFU/mL的初始菌液。首先在96孔板上加入100 μL無菌BHI培養(yǎng)基,吸取100μL環(huán)丙沙星母液在96孔板上,使用二倍稀釋法進行稀釋。每孔接種100μL的初始菌液,并加入終質(zhì)量濃度為20μg/mL的利血平,Parafilm封口膜封板后37℃培養(yǎng)18～20 h,使用EPOCH2微孔板分光光度計讀取每個孔的OD595吸光值。根據(jù)OD595吸光值進行判斷,培養(yǎng)基中未見菌體生長的環(huán)丙沙星最低濃度值即為MIC值。加入利血平后MIC值下降4倍及以上的菌株視為外排泵陽性菌株。

1.2.5 遺傳多樣性分析實驗

利用多重PCR進行耐受喹諾酮類抗生素的LM分離菌株血清組分析[16]。該多重PCR可將13種血清型的單增李斯特菌分為血清組Ⅰ.1(血清型1/2a和3a),Ⅰ.2(血清型1/2c和3c),Ⅱ.1(血清型4b,4d和4e),Ⅱ.2(血清型1/2b,3b和LM)和Ⅲ(血清型4a和4c)。反應(yīng)體系為50μL,包含25.0 μL 2×DreamTaq Green PCR Master Mix,prs正反向引物各 0.15 μmol/L,Lmo0737、Lmo1118、ORF2819、ORF2110正反向引物各0.3μmol/L以及2μL基因組DNA,用滅菌ddH2O補齊至50μL。擴增條件為94℃預變性3 min;94℃變性30 s,53℃退火70 s,72℃延伸70 s,35個循環(huán)后,72℃延伸10 min。產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠(含0.005%gold-view staining)電泳進行分離(100 V,40 min),利用 Tanon 2500UV照相系統(tǒng)拍照并保存為TIFF格式。

通過擴增LM的7個管家基因(abcZ,bglA,cat,dapE,dat,ldh和lhkA)進行MLST分析,管家基因的引物序列[17],ldh引物由本研究設(shè)計(ldhF：5′GACAGAACAATTGGGGATGCAATG;ldhR：AACGCCGTAGAATGTAGCGCCT)。PCR體系為50μL,包含5×PrimeSTAR buffer(Mg2+Plus)10μL,dNTPmixture(10 mmol/L)4μL,正向引物與反向引物各0.3 μmol/L,2μL基因組DNA以及1.25 U DNA聚合酶。PCR擴增條件：94℃預變性4 min,94℃變性30 s,52℃退火30 s(bglA為45℃以及l(fā)dh為60℃),72℃延伸2 min,35個循環(huán)之后,72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物進行雙向測序,利用法國巴斯德研究所Listeria MLST數(shù)據(jù)庫(http：∥bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html)進行MLST分析?；贛LST的7個管家基因(abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh 和 lhkA)連鎖序列,利用 MEGA 7.0構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素敏感性結(jié)果分析

對945株食源性單核細胞增生李斯特菌進行抗生素敏感性分析發(fā)現(xiàn),其中有6株(0.63%)對左氧氟沙星耐藥,32株(3.39%)對環(huán)丙沙星耐藥,30株(3.17%)對氧氟沙星耐藥;另外,有 142株(15.03%)對左氧氟沙星中度耐藥,367株(38.84%)對環(huán)丙沙星中度耐藥,300株(31.75%)對氧氟沙星中度耐藥。本實驗選擇32株喹諾酮類耐藥的LM菌株進一步研究(圖1)。

2.2 環(huán)丙沙星MIC實驗結(jié)果分析

32株LM菌株對環(huán)丙沙星的藥物敏感性結(jié)果,如表4。表4顯示,8株LM對環(huán)丙沙星MIC值為4μg/mL,8株對環(huán)丙沙星MIC值為8μg/mL,9株對環(huán)丙沙星MIC值為16μg/mL,5株對環(huán)丙沙星MIC值為32μg/mL,2株對環(huán)丙沙星MIC值為256μg/mL。加入外排泵抑制劑利血平后,32株對喹諾酮耐藥的LM的MIC值發(fā)生變化;其中,有7株的MIC值沒有發(fā)生變化,有15株對環(huán)丙沙星的MIC值降低為原來的1/2,9株降低為原來的1/4,1株降低為原來的1/8。對32株喹諾酮類抗生素耐藥的LM進行l(wèi)de基因的PCR擴增,結(jié)果如圖2。32株喹諾酮類抗生素耐藥的LM菌株中皆含有l(wèi)de基因。

2.3 QRDR基因突變和PMQR基因檢測結(jié)果分析

對32株喹諾酮耐藥LM菌株的gyrA、gyrB、parC、parE以及fepR基因QRDR進行測序,經(jīng)過基因序列比對后發(fā)現(xiàn),5個基因均有一定的堿基突變。其中,gyrA、gyrB、parC、parE 4個基因雖然發(fā)現(xiàn)堿基突變,但均屬于同義突變,未引起氨基酸序列的變化。如表4所示,fepR基因發(fā)現(xiàn)了7個突變位點,且引起了氨基酸突變,但均非文獻報道的關(guān)鍵突變位點(G61T)[18]。對32株喹諾酮耐藥的LM進行PMQR基因的PCR擴增,均未檢出qnr基因。

圖1 32株喹諾酮耐藥LM分離菌株特性分析Fig.1 Characteristics of 32 quinolone-resistant Listeria monocytogenes isolates

2.4 遺傳多樣性分析

如圖1所示,采用多重PCR技術(shù)對32株喹諾酮類抗生素耐藥的LM進行血清組分析,有15株屬于血清組Ⅰ.1(血清型1/2a和3a),8株屬于血清組Ⅰ.2(血清型1/2c和3c),1株屬于血清組Ⅱ.1(血清型4b,4d和4e),7株屬于血清組Ⅱ.2(血清型1/2b,3b和7),1株屬于血清組Ⅲ血(清型4a和4c)。MLST分型技術(shù)將32株耐受喹諾酮類抗生素的LM 分屬 10種 STs型,分別為 ST7、ST8、ST9、ST87、ST101、ST121、ST155、ST299、ST307 和 ST308。其中,ST87(7株)、ST9(8株)、ST8(6株)和 ST155(5株)為優(yōu)勢ST型。

表4 加入利血平前后LM菌株對環(huán)丙沙星的MIC值以及fepR的突變情況Tab.4 MIC values of ciprofloxacin with or without addition of reserpine and mutation of fepR

3 討 論

喹諾酮類藥物的抗菌機制是通過在染色體DNA上形成DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的三元復合物進行的[19],而細菌通過在靶基因DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的關(guān)鍵氨基酸位點發(fā)生氨基酸置換,是一個產(chǎn)生喹諾酮類藥物耐藥的重要機制[20]。Friedman等[19]對喹諾酮類耐藥的大腸桿菌進行研究,在GyrA的 QRDR 中發(fā)現(xiàn) S83L、A51V、A67S、G81C、S83W、D87N、Q106H、D82A、A84P以及D87Y十個氨基酸突變位點;Zaki等[21]對喹諾酮類耐藥的鮑曼不動桿菌進行研究,發(fā)現(xiàn)在gyrA的83號密碼子以及parC的80號密碼子發(fā)生了氨基酸突變。Zhang等[22]在喹諾酮類耐藥的副豬嗜血桿菌中發(fā)現(xiàn)了gyrA(D87N)、parC(S73R)以及par(ET551A)幾個喹諾酮相關(guān)氨基酸突變位點。本研究中,32株喹諾酮類耐藥LM菌株的gyrA、gyrB、parC、parE四個基因的氨基酸序列與敏感株相比,并沒有發(fā)生變化;而在fepR中,雖然有個別菌株發(fā)生了氨基酸序列變化,但并非文獻報道的關(guān)鍵突變位點(G61T)[18],這些氨基酸突變位點是否導致喹諾酮類抗生素耐藥仍需進一步研究。同時,本研究對5個PMQR進行了PCR檢測,結(jié)果顯示,這32株均未攜帶PMQR基因,說明喹諾酮耐藥LM菌株均未攜帶含qnr系列基因的耐藥質(zhì)粒。QRDR和PMDR分析結(jié)果表明,外排泵有可能是介導LM菌株喹諾酮耐藥的重要因素。

圖2 喹諾酮類耐藥LM分離菌株lde基因電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of lde gene of quinoloneresistant Listeria monocytogenes isolates

細菌外排泵的功能主要將細胞內(nèi)的抗生素排出細胞外,使得細菌細胞內(nèi)保持低濃度的抗生素,從而導致細菌產(chǎn)生耐藥性。Paltansing等[9]研究發(fā)現(xiàn),外排泵基因的高水平表達可導致大腸桿菌產(chǎn)生喹諾酮類抗生素耐藥。Shen等[23]對沙門氏菌的外排泵進行研究發(fā)現(xiàn),外排泵AcrAB能介導沙門氏菌產(chǎn)生喹諾酮類抗生素耐藥。Godreuil等[1]通過在LMCLIP 21369菌株基因組中插入失活lde基因,比較突變株與野生株的喹諾酮類抗生素耐藥性發(fā)現(xiàn),突變株的環(huán)丙沙星與諾氟沙星耐藥性只有野生株的1/3～1/4,而且突變株的耐藥性不會受到利血平的影響。可見外排泵是細菌產(chǎn)生耐藥性的一種重要機制。利血平是一種吲哚型生物堿,能夠抑制外排泵將喹諾酮類抗生素泵出細胞外。本研究對32株喹諾酮類抗生素耐藥的LM進行l(wèi)de基因的PCR擴增,發(fā)現(xiàn)這32株LM耐藥株均檢測出lde基因;但加入利血平后,10株分離株對環(huán)丙沙星的MIC值降低至原來的1/4以下,其中9株降低為原MIC的1/4,1株降低為原MIC的1/8,表明這10株菌外排泵是介導其對喹諾酮類抗生素耐藥的關(guān)鍵因素。另外22株LM在加入利血平后對環(huán)丙沙星的MIC值下降不明顯(降為原MIC的1/2)或是沒發(fā)生變化,表明lde外排泵對這些菌株產(chǎn)生喹諾酮類抗生素耐藥性影響不大。Jiang等[6]研究發(fā)現(xiàn),外排泵基因lde在耐藥株和敏感株中均有表達,且表達量相近;但在環(huán)丙沙星的作用下,lde基因在耐藥株中的相對表達量顯著增加,而在敏感株中的表達量基本沒有變化,表明lde基因在菌株中的表達水平直接影響菌株對喹諾酮類抗生素的耐受性。

不同血清型的LM致病力具有差異,95%臨床源分離株屬于血清型1/2a,1/2b和4b。本研究32株喹諾酮類抗生素耐藥菌株中,其中血清組Ⅰ.1(血清型1/2a和3a)15株,血清組Ⅰ.2(血清型1/2c和3c)8株,血清組Ⅱ.1(血清型4b,4d和4e)1株,血清組Ⅱ.2(血清型1/2b,3b和7)7株,血清組Ⅲ(血清型4a和4c)1株,表明血清組Ⅰ.1,Ⅱ.2和Ⅰ.2在喹諾酮類耐藥菌株中占優(yōu)勢。同時,MLST分析發(fā)現(xiàn) ST87、ST8、ST9和 ST155為優(yōu)勢 STs型。閆韶飛等[24]對2012年中國食源性LM耐藥特征及多位點序列分型研究發(fā)現(xiàn),ST155、ST9、ST705和ST87為我國LM耐藥株常見型別。這些常見的耐藥STs應(yīng)該引起重視,其獲得耐藥的分子機制仍需進一步研究。Wang等[25]在四川省自貢市臨床源分離株中發(fā)現(xiàn),ST87、ST8和ST155是主要的致病ST型,說明32株耐喹諾酮類抗生素的LM分離株具有一定的致病能力,其對公眾健康造成的潛在威脅值得重視。

4 結(jié) 論

本研究對從全國各地食品樣品中分離的32株喹諾酮類抗生素耐藥的LM進行研究,以期探討LM喹諾酮類耐藥的分子機制。結(jié)果表明,LM耐藥株中的gyrA、gyrB、parC以及parE沒有發(fā)生基因突變引起的氨基酸置換,在fepR中雖然發(fā)現(xiàn)有基因突變引起的氨基酸置換,但并非文獻報道的突變位點,這些突變位點是否與喹諾酮類耐受性相關(guān)仍需進一步研究;同時這32株LM耐藥株也未檢出PMQR基因。通過外排泵抑制實驗發(fā)現(xiàn),外排泵lde可能是介導LM產(chǎn)生喹諾酮類抗生素耐藥的重要因素,但lde基因表達水平是決定其耐藥性強弱的關(guān)鍵因素。遺傳多樣性分析表明,32株喹諾酮耐藥菌株具有潛在的致病性,應(yīng)引起重視。