董志成, 劉凌翔

(1. 南京醫(yī)科大學(xué), 江蘇 南京, 210029;2. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 南京, 210029)

甲胎蛋白(AFP)是肝癌及生殖細(xì)胞惡性腫瘤的主要標(biāo)志物。胃癌可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生AFP, 而血清AFP陽(yáng)性胃癌(AFPGC)患者易發(fā)生轉(zhuǎn)移，生存率明顯低于血清AFP陰性胃癌患者，預(yù)后較差。人表皮生長(zhǎng)因子受體2 (HER2)、切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組1 (ERCC1)及胸甘酸合成酶(TS)是胃癌治療及預(yù)后的重要分子標(biāo)志物，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于上述3種分子標(biāo)志物在AFPGC中的相關(guān)研究尚無(wú)明確結(jié)論。本研究分析3者在中國(guó)AFPGC人群及普通胃癌中的表達(dá)差異，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2012年4月—2016年6月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的胃癌組織蠟塊，其中血清AFP陽(yáng)性胃癌(經(jīng)病理學(xué)確診胃癌，血清AFP≥10 μg/L, 排除肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌、肝轉(zhuǎn)移癌及惡性生殖細(xì)胞腫瘤等可能產(chǎn)生AFP的疾病) 61例作為實(shí)驗(yàn)組，包括Ⅰ期5例, Ⅱ期11例, Ⅲ期45例; 男46例，女15例; 年齡42～79歲，平均(62.7±8.5)歲。與實(shí)驗(yàn)組性別、年齡及腫瘤分期一致的普通胃癌(經(jīng)病理學(xué)確診胃癌，血清AFP<10 μg/L) 122例作為對(duì)照組，其中Ⅰ期10例, Ⅱ期22例, Ⅲ期90例; 男92例，女30例; 年齡32～86歲，平均(63.0±10.9)歲。隨訪(fǎng)截止時(shí)間為2016年6月30日，隨訪(fǎng)2～45個(gè)月，中位隨訪(fǎng)時(shí)間33月。采集所有病例的生存期及臨床病理特征，包括性別、年齡、TNM分期、分化程度、腫瘤部位、大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)脈管侵犯及血清AFP水平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化檢測(cè): 采用免疫組織化學(xué)法(Envision法)。一抗采用的是即用型HER2兔抗人單克隆抗體、即用型ERCC1鼠抗人單克隆抗體及即用型TS鼠抗人單克隆抗體，二抗采用的是免疫組化Envision plus廣譜試劑盒，以上均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。選擇研究石蠟標(biāo)本, 3～4 μm切片, 60 ℃過(guò)夜，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，檸檬酸(pH值6.0)微波抗原修復(fù)，滴加一抗, 4 ℃過(guò)夜, PBS沖洗后滴加二抗，室溫下孵育30 min, DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。已知陽(yáng)性切片在同條件下染色作為陽(yáng)性對(duì)照, PBS代替一抗為陰性對(duì)照。

1.2.2 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn): HER2的免疫組化染色陽(yáng)性表達(dá)主要在細(xì)胞膜，呈棕黃色，采用Hofmann標(biāo)準(zhǔn)[1]: 不染色或<10%腫瘤細(xì)胞膜染色為(-); ≥10%腫瘤細(xì)胞微弱或隱約見(jiàn)到膜染色或僅有部分腫瘤細(xì)胞膜染色為(+); ≥10%腫瘤細(xì)胞見(jiàn)到弱到中度的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜染色為(); ≥10%腫瘤細(xì)胞的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜強(qiáng)染色為(); 結(jié)果以()、()為陽(yáng)性表達(dá)(因2者包含大部分有機(jī)會(huì)使用曲妥珠單抗的病例，故均設(shè)為陽(yáng)性)，以(-)、(+)為陰性表達(dá)。ERCC1及TS的免疫組化染色陽(yáng)性表達(dá)分別主要在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，均呈棕黃色, 2者均在光學(xué)顯微鏡高倍鏡(400倍)下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野記200個(gè)細(xì)胞，依據(jù)細(xì)胞染色程度及染色細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分。染色程度: 基本無(wú)染色為0分，染淡黃色為1分，染棕黃色為2分，染深褐色為3分; 染色細(xì)胞所占百分比: <5%為0分, 5%～<24%為1分, 24%～<50%為2分, ≥50%為3分; 綜合兩種評(píng)分，取分值較少者為最后判定結(jié)果: 0分為(-)，1分為(+), 2分為(), 3分為(); 結(jié)果以(+)、()、()為陽(yáng)性表達(dá)，以(-)為陰性表達(dá)。以上結(jié)果均由2位病理醫(yī)師進(jìn)行盲法判讀，結(jié)果不一致時(shí)協(xié)商而定或取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中HER2、ERCC1及TS的表達(dá)差異，并分析2組中3者的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，分析兩組臨床病理特征之間的關(guān)系。采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析2組中3者之間表達(dá)的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法描繪生存曲線(xiàn)，采用Log-rank法分別對(duì)總樣本中AFP、HER2、ERCC1及TS之陽(yáng)性與陰性組的生存期進(jìn)行比較，并對(duì)總樣本中臨床病理特征對(duì)生存期的影響進(jìn)行單因素預(yù)后分析，再將有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的臨床病理特征納入多因素預(yù)后Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析出獨(dú)立預(yù)后因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組臨床病理特征的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組患者性別、年齡、TNM分期、分化程度、腫瘤部位、大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及神經(jīng)脈管侵犯比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 具有均衡性。

2.2 2組中HER2、ERCC1及TS的表達(dá)的差異

胃癌中HER2、ERCC1及TS的免疫組化染色分別主要在細(xì)胞膜、細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，均呈棕黃色。見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中HER2的陽(yáng)性率分別為45.90%、30.33%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.038); ERCC1的陽(yáng)性率分別為70.49%、61.48%, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.23); TS的陽(yáng)性率分別為80.33%、63.93%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)。見(jiàn)表1、2、3。

圖1 Envision法檢測(cè)胃癌中HER2、ERCC1及TS的免疫組化染色(200倍)

表1 2組HER2表達(dá)差異比較

與對(duì)照組比較, *P<0.05。

表2 2組ERCC1表達(dá)差異比較

表3 2組TS表達(dá)差異比較

與對(duì)照組比較, *P<0.05。

2.3 2組中HER2、ERCC1及TS的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)組中HER2在Ⅰ～Ⅱ期組的陽(yáng)性率顯著高于Ⅲ期組(P=0.033), 而與其他臨床病理特征無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05); ERCC1及TS的表達(dá)與臨床病理特征均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表4。對(duì)照組中ERCC1在有神經(jīng)脈管侵犯組的陽(yáng)性率顯著高于無(wú)侵犯組(P=0.036), 而與其他臨床病理特征無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05); HER2及TS的表達(dá)與臨床病理特征均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。

2.4 2組中HER2、ERCC1及TS表達(dá)的相關(guān)性

實(shí)驗(yàn)組中HER2與ERCC1的表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性(r=-0.05,P=0.700); HER2與TS的表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性(r=0.148,P=0.255); ERCC1與TS的表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性(r=0.076,P=0.563)。對(duì)照組中HER2與ERCC1的表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性(r=0.153,P=0.093); HER2與TS的表達(dá)顯著正相關(guān)(r=0.287,P=0.001); ERCC1與TS的表達(dá)顯著正相關(guān)(r=0.256,P=0.004)。

表4 實(shí)驗(yàn)組中HER2、ERCC1及TS的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

與HER2陰性比較, *P<0.05。

2.5 總樣本中AFP、HER2、ERCC1及TS陽(yáng)性與陰性組的生存差異

至隨訪(fǎng)截止時(shí)間，總樣本中AFP陽(yáng)性與陰性組的中位生存期分別為19、35月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,Log-rank值=13.245); HER2陽(yáng)性與陰性組的中位生存期分別為30、34月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,Log-rank值=13.551); ERCC1陽(yáng)性與陰性組的中位生存期分別為32.5、35月，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.684,Log-rank值=0.166); TS陽(yáng)性與陰性組的中位生存期分別為32、36月，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.123,Log-rank值=2.378)。見(jiàn)圖2。AFP陽(yáng)性HER2陰性組與AFP陰性HER2陽(yáng)性組的中位生存期分別為16、32月，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.423,Log-rank值=0.643)。

2.6 總樣本中臨床病理特征對(duì)生存期的影響

單因素預(yù)后分析顯示, TNM分期(P=0.003,Log-rank值=8.629)、浸潤(rùn)深度(P=0.009,Log-rank值=6.734)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.023,Log-rank值=5.154)、腫瘤大小(P=0.012,Log-rank值=6.317)及血清AFP水平(P<0.001,Log-rank值=13.245)對(duì)生存期有顯著的負(fù)性影響，而其他臨床病理特征未影響生存期(P>0.05)。將上述有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入多因素預(yù)后分析顯示，浸潤(rùn)深度(RR=1.862,P=0.039)、血清AFP水平(RR=1.002,P<0.001)為獨(dú)立預(yù)后因素，即調(diào)整浸潤(rùn)深度后，血清AFP水平每增加1 μg/L, 死亡風(fēng)險(xiǎn)將增加0.2%。

HER2(+) vs HER2(-) (P<0.001 Log-rank值=13.551); ERCC1(+) vs ERCC1(-) (P=0.684 Log-rank值=0.166); TS(+) vs TS(-) (P=0.123 Log-rank值=2.378)。圖2 總樣本中HER2、ERCC1及TS陽(yáng)性與陰性組的生存差異

3 討 論

血清AFP陽(yáng)性胃癌(AFPGC)相較于普通胃癌，其惡性程度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。Kono等[2]研究發(fā)現(xiàn), AFPGC的浸潤(rùn)深度、分期、肝臟及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率均高于普通胃癌，其術(shù)后生存率明顯低于普通胃癌。Liu等[3]研究提示, AFPGC的獨(dú)立預(yù)后因素為肝轉(zhuǎn)移和病理分期。本研究單因素預(yù)后分析顯示, TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及血清AFP水平對(duì)生存期有負(fù)性影響，多因素預(yù)后分析顯示胃癌的浸潤(rùn)深度、血清AFP水平為獨(dú)立預(yù)后因素，調(diào)整浸潤(rùn)深度后，血清AFP水平每增加1 μg/L, 死亡風(fēng)險(xiǎn)將增加0.2%。一般認(rèn)為, TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為胃癌的預(yù)后因素，作者分析可能由于多數(shù)AFPGC手術(shù)時(shí)病期偏晚，收集的Ⅲ期胃癌相對(duì)較多，預(yù)后多數(shù)較差而影響結(jié)果。目前AFPGC治療上較多參考普通胃癌，但療效相對(duì)較差。人表皮生長(zhǎng)因子受體2 (HER2)、切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組1 (ERCC1)及胸甘酸合成酶(TS)是與胃癌治療及預(yù)后相關(guān)的重要分子標(biāo)志物，臨床上與此相關(guān)的藥物如曲妥珠單抗、鉑類(lèi)及氟尿嘧啶類(lèi)是目前胃癌治療的重要藥物。

HER2是由其原癌基因編碼的一種跨膜酪氨酸激酶受體，正常情況下處于非激活狀態(tài)。HER2經(jīng)基因突變被激活，與配體結(jié)合后引起受體二聚化及酪氨酸激酶的自身磷酸化，激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，其基因擴(kuò)增及蛋白過(guò)表達(dá)參與了促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促使腫瘤新生血管形成，增強(qiáng)腫瘤侵襲能力，破壞機(jī)體抗侵襲屏障等[4]。可能由于研究樣本、檢測(cè)方法及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)等差異，各研究[1, 5-6]中胃癌的HER2過(guò)表達(dá)率為7%～34%。國(guó)際多中心Ⅲ期臨床研究ToGA[7]中胃癌的HER2陽(yáng)性率[IHC()或IHC()/FISH(+)]為22.1%。本研究顯示，普通胃癌中HER2的陽(yáng)性率為30.33%, 明顯低于AFPGC的45.9%。多項(xiàng)研究[1, 5-6, 8-9]顯示HER2過(guò)表達(dá)與胃癌臨床病理特征無(wú)關(guān)，但與預(yù)后差有關(guān)。本研究亦顯示HER2陽(yáng)性胃癌的生存期明顯短于陰性者，并且HER2陽(yáng)性AFP陰性與AFP陽(yáng)性HER2陰性胃癌的生存期無(wú)顯著差異，提示HER2與AFP的陽(yáng)性表達(dá)對(duì)胃癌預(yù)后的影響近似。本研究未顯示普通胃癌中HER2的表達(dá)與臨床病理特征有關(guān)，亦未顯示AFPGC中HER2的表達(dá)與除TNM分期外的臨床病理特征有關(guān)，而其在Ⅰ～Ⅱ期組的陽(yáng)性率明顯高于Ⅲ期，作者分析可能由于早晚期腫瘤的驅(qū)動(dòng)基因差異，或由于多數(shù)AFPGC手術(shù)時(shí)病期偏晚，收集的Ⅰ～Ⅱ期樣本量相對(duì)偏少而影響結(jié)果。曲妥珠單抗是一種重組人源化單克隆抗體，作用于HER2的胞外區(qū)域，其抗腫瘤機(jī)制主要有: 阻斷信號(hào)傳導(dǎo)通路直接抑制腫瘤增殖，并激活凋亡信號(hào); 經(jīng)抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性作用間接殺滅腫瘤[10]。ToGA[7]研究證實(shí)，曲妥珠單抗聯(lián)合化療可改善HER2陽(yáng)性晚期胃癌的總生存期，確立了曲妥珠單抗在晚期胃癌中的治療地位。本研究顯示AFPGC中HER2的陽(yáng)性率明顯高于普通胃癌，提示雖不能代替HER2基因檢測(cè)，但AFPGC可能在曲妥珠單抗靶向治療中有更多獲益。

切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組1 (ERCC1)是由其基因編碼的一種具有核苷酸切除修復(fù)(NER)功能的蛋白，其能夠識(shí)別DNA損傷并切除5′端損傷部位，在NER途徑中起到調(diào)節(jié)及限速的重要作用[11]。各研究中胃癌的ERCC1陽(yáng)性率為32%～70%[12]。本研究顯示AFPGC與普通胃癌中ERCC1的陽(yáng)性率分別為70.49%、61.48%, 無(wú)明顯差異。多項(xiàng)研究[13-15]顯示肺癌中ERCC1陽(yáng)性表達(dá)則預(yù)后較好，但胃癌中尚未有相關(guān)報(bào)道。本研究顯示ERCC1陽(yáng)性與陰性胃癌的生存期無(wú)明顯差異，未顯示AFPGC中ERCC1的表達(dá)與臨床病理特征有關(guān)，而普通胃癌中ERCC1在有神經(jīng)脈管侵犯者的陽(yáng)性率明顯高于無(wú)侵犯者，這尚未有相關(guān)報(bào)道。除此之外，普通胃癌中ERCC1的表達(dá)與其余臨床病理特征無(wú)關(guān)。鉑類(lèi)是胃癌常用化療藥，其通過(guò)形成鉑-DNA復(fù)合物，使DNA鏈內(nèi)或鏈間交聯(lián)，干擾DNA轉(zhuǎn)錄及復(fù)制，引起腫瘤細(xì)胞凋亡，而ERCC1是對(duì)鉑類(lèi)所致腫瘤細(xì)胞DNA損傷進(jìn)行修復(fù)的主要途徑[16]。Meta分析[12, 17]顯示ERCC1的表達(dá)與胃癌鉑類(lèi)化療療效預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。本研究顯示AFPGC中ERCC1的陽(yáng)性率高于普通胃癌，但無(wú)顯著差異, AFPGC是否更有可能對(duì)鉑類(lèi)化療存在耐藥有待進(jìn)一步研究。

胸甘酸合成酶(TS)是由其基因編碼的二聚體蛋白，其功能是催化尿嘧啶脫氧核苷(dUMP)甲基化轉(zhuǎn)為胸腺嘧啶脫氧核苷(dTMP), 此步驟為DNA合成所必需，故抑制TS便可抑制DNA合成，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖[18]。各研究中胃癌的TS陽(yáng)性率為32%～66%[19-20]。本研究顯示普通胃癌中TS的陽(yáng)性率為63.93%, 明顯低于AFPGC的80.33%。胃癌中TS表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系目前仍存在爭(zhēng)議，有研究[21-22]顯示胃癌中TS陽(yáng)性表達(dá)則預(yù)后較差。本研究顯示TS陽(yáng)性與陰性胃癌的生存期無(wú)顯著差異，未顯示AFPGC及普通胃癌中TS的表達(dá)與臨床病理特征有關(guān)。氟尿嘧啶類(lèi)是胃癌常用化療藥，其進(jìn)入細(xì)胞后轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶脫氧核苷，與TS結(jié)合形成復(fù)合物，抑制TS活性，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成[23]。Meta分析[19-20]顯示TS的表達(dá)與胃癌氟尿嘧啶類(lèi)化療療效預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。本研究顯示AFPGC中TS的陽(yáng)性率明顯高于普通胃癌，提示AFPGC更有可能對(duì)氟尿嘧啶類(lèi)化療存在耐藥。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn), AFPGC中HER2的陽(yáng)性率明顯高于普通胃癌，提示AFPGC可能在曲妥珠單抗靶向治療中有更多獲益; AFPGC中TS的陽(yáng)性率明顯高于普通胃癌，提示AFPGC更有可能對(duì)氟尿嘧啶類(lèi)化療存在耐藥。