唐 燕, 楊雪琴, 高利增, 3

(揚州大學(xué), 1. 醫(yī)學(xué)院; 2. 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院;3. 江蘇省非編碼RNA基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點實驗室, 江蘇揚州, 225001)

納米酶是具有類酶催化活性的納米材料，能夠在近生理條件下催化生物酶的底物，其催化行為、反應(yīng)動力學(xué)和催化機制均與天然酶相同，因此屬于新一代人工模擬酶[1-4]。與天然酶和傳統(tǒng)的模擬酶相比，納米酶具有催化效率高、功能多、穩(wěn)定性好、成本低、易于大規(guī)模制備等優(yōu)點，尤其是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，納米酶不僅可以用于快速檢測多種細菌、病毒、腫瘤標志物和血糖[5], 還可以應(yīng)用于腫瘤診斷和治療[6]、抗耐藥菌和生物膜[7]、保護細胞以及抗衰老[8]等與人類健康相關(guān)的重要領(lǐng)域。

目前圍繞納米酶的研究主要包括開發(fā)和設(shè)計新型納米酶、催化機制和應(yīng)用3個方面。目前約有50多種不同種類和結(jié)構(gòu)的納米酶被開發(fā)，主要包括金屬氧化物納米酶、貴金屬納米酶和碳類納米酶。四氧化三鐵(Fe3O4)納米酶屬于較早發(fā)現(xiàn)的典型的金屬氧化物納米酶。作者在2007年首次報道了Fe3O4納米顆粒具有類過氧化物酶催化活性[9], 能夠催化辣根過氧化物酶(HRP)的底物，即過氧化氫(H2O2)和顏色底物，在酸性條件下產(chǎn)生與酶催化一致的顏色反應(yīng)。2012年顧寧課題組[10]又發(fā)現(xiàn)Fe3O4納米酶具有過氧化氫酶(CAT)催化活性，可以在中性條件下將雙氧水分解為氧氣和水。因此Fe3O4納米酶具有過氧化物酶和過氧化氫酶活性，兩種活性的發(fā)揮依賴于環(huán)境pH值。由于Fe3O4納米材料還具有優(yōu)良的磁學(xué)性能，將催化與磁性相結(jié)合將進一步拓展這一材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[11]。

Fe3O4納米酶為什么能夠模擬HRP和CAT的活性呢？通過分析天然HRP和CAT蛋白結(jié)構(gòu)特點發(fā)現(xiàn)，這兩種天然酶催化活性中心均為鐵卟啉(porphyrin)，而且正是卟啉環(huán)中心的鐵原子通過變價效應(yīng)對催化起到了至關(guān)重要的作用(圖1A)。相應(yīng)的，在Fe3O4納米酶表面存在大量的二價鐵(Fe2+)和三價鐵(Fe3+), 這些鐵與氧形成特定的納米晶體結(jié)構(gòu)[12](圖1B)。與天然酶中的鐵相似, Fe3O4納米酶表面的鐵原子也具有變價能力，因此能夠模擬天然酶催化活性。眾所周知，天然酶作為一種蛋白質(zhì)其催化過程除了活性中心外，周邊的原子或氨基酸殘基也參與催化過程，并對活性具有調(diào)節(jié)作用。比如HRP酶的鐵卟啉活性中心的周邊有組氨酸的咪唑環(huán)參與催化過程。受此啟發(fā)，作者在2017年發(fā)現(xiàn)將組氨酸修飾到Fe3O4納米酶表面可以提高其過氧化物酶和過氧化氫酶活性。進一步分析HRP酶的結(jié)構(gòu)特點，有報道[13]發(fā)現(xiàn)該蛋白在催化活性中心的遠端還具有2個鈣(Ca)原子(圖1A), 有可能對催化活性也具有調(diào)節(jié)作用。作者據(jù)此推測鈣有可能影響Fe3O4納米酶的催化活性。

根據(jù)上述科學(xué)假設(shè)，作者研究了鈣摻雜到Fe3O4納米酶的條件和方法，驗證和分析了鈣摻雜到納米結(jié)構(gòu)的效率，對比了摻雜后對兩種酶催化活性的影響，并檢驗了鈣摻雜Fe3O4(Ca-Fe3O4)納米酶的抗病毒效果，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

3, 3′, 5, 5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、無水氯化鐵和乙二醇均從Sigma公司訂購，室溫避光儲存?zhèn)溆谩?0% H2O2、三水醋酸鈉和氯化鈣均從生工公司訂購，室溫儲存?zhèn)溆?。犬腎細胞(MDCK)用于分離和培養(yǎng)流感病毒，由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院重點實驗室惠贈，流感病毒(A/Chicken/jiangsu/1/2013, H3N2-IFV), 分離于活禽市場，由本實驗室鑒定擴增保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 鈣摻雜Fe3O4納米酶的制備: 通過水熱合成法制備Ca元素摻雜的Fe3O4納米酶。首先, 0.82 g的無水氯化鐵通過磁力攪拌完全溶于40 mL的乙二醇中，形成澄清的溶液。接著，緩慢加入3.6 g的三水醋酸鈉，快速攪拌，形成均勻混懸液。再加入適量的氯化鈣，充分攪拌，再超聲10 min, 使上述溶液充分的混合均勻。然后，將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL聚四氟乙烯反應(yīng)釜中。最后，將反應(yīng)釜置于200 ℃下加熱12 h。待反應(yīng)釜自然冷卻到室溫后，得到黑色沉淀物，即Ca元素摻雜的Fe3O4納米酶。然后，用乙醇和水洗滌產(chǎn)物各3次。最終，將得到的黑色沉淀物分散在乙醇中，放置4 ℃冰箱待用。利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)(型號S-4800, 日本日立公司)、透射電子顯微鏡(TEM)(型號Tecnai 12, 荷蘭Philips公司)、X射線光電子能譜儀(XPS)(型號ESCALAB250Xi, 美國ThermoFisher Scientific)、馬爾文激光粒度儀(型號Zetasizer Nano, 英國Malvern公司)分別進行了尺寸和形貌、元素掃描和定量分析、表面電勢進行了物理化學(xué)表征。

1.2.2 鈣摻雜對Fe3O4納米酶過氧化物酶活性的影響: 催化底物 H2O2的酶促動力學(xué)參數(shù)測定，檢測方法是在200 μL的體系中，將10 μg的Ca-Fe3O4納米酶加入到0.1 mol/L、pH值4.5的醋酸鈉溶液中，加入40 μg的TMB, 加入不同量的H2O2,通過酶標儀檢測652 nm下的光吸收值，并在 37 ℃下測量反應(yīng)速率5 min。對于納米酶，加入H2O2的濃度梯是0、18.63、37.13、74.25、148.50、297.59、594.00、1 188.00 mmol/L。相應(yīng)的米氏方程(Michaelis-Menten kinetics)曲線和反應(yīng)速率通過使用GraphPad Prism7軟件獲得。

1.2.3 鈣摻雜對Fe3O4納米酶的過氧化氫酶活性的影響: 校正溶解氧電極，檢查校正參數(shù)，用5%新鮮配制的亞硫酸鈉開始校正“零氧”，隨后在空氣中校正“滿度”，保存校正結(jié)果報告。檢測方法是在3 mL的體系中，將150 μg的Ca-Fe3O4納米酶加入到0.1 mol/L、pH值4.5的醋酸鈉溶液中，加入不同量的H2O2, 靜置10 min后，利用溶氧儀檢測氧氣產(chǎn)生的速度。應(yīng)用GraphPad Prism7軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用米氏方程分析催化參數(shù)并比較催化效率。

1.2.4 鈣摻雜Fe3O4納米酶的抗病毒測試: 檢測其對胞內(nèi)抗H3N2-IFV病毒增殖的作用，將活病毒液感染MDCK細胞，充分吸附1 h后棄病毒液，加入含不同濃度Fe3O4納米酶的培養(yǎng)基, 5 d后取上清液，測血凝(HA)效價。其對H3N2-IFV的直接滅活的效應(yīng)，先將不同濃度的納米酶分別與等量H3N2-IFV液充分混合作用1 h和24 h后，直接測其HA效價。

2 結(jié) 果

2.1 鈣摻雜Fe3O4納米酶的制備與表征

作者采用了常規(guī)的水熱合成法(又稱溶劑熱法)合成了Fe3O4納米酶，這是合成制備該類納米酶最常用的的實驗方法。整個反應(yīng)體系在密閉的反應(yīng)釜內(nèi)進行，加熱到200 ℃會產(chǎn)生高壓環(huán)境，引發(fā)納米顆粒成核聚集。這一合成方法不僅簡便快速易于規(guī)?；a(chǎn)，而且可以在反應(yīng)液中加入化學(xué)分子或高聚物，合成好的納米顆粒表面就會修飾上相應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)?；谶@一反應(yīng)特色，作者在納米酶合成反應(yīng)的前體液中加入適量的氯化鈣，待Fe3O4納米酶合成好后即可實現(xiàn)鈣的摻雜。實驗中作者發(fā)現(xiàn)在容積為50 mL的反應(yīng)釜中經(jīng)過1個制備過程可以得到約300 mg Fe3O4納米酶。運用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡來觀察Ca元素摻雜后Fe3O4納米酶的形態(tài)及粒徑，通過Ca元素摻雜前后的SEM和TEM圖片，可以看出納米酶大致呈球形，粒徑均在200 nm左右，沒有明顯的差別(見圖1C、1D)。摻雜了Ca之后，納米酶表面發(fā)生了褶皺，這種形貌將會增大納米顆粒的比表面積。

元素掃描分析顯示，摻雜后的納米顆粒表面含有鈣元素(圖2A、B)運用能量色散譜儀(EDS)來檢測Fe3O4納米酶摻雜的Ca元素含量。通過鈣元素摻雜前后的EDS圖片可以看出，能譜數(shù)據(jù)顯示出了Ca元素的特征峰，這表明Ca元素摻雜到Fe3O4納米酶。運用X射線光電子能譜對Ca元素摻雜的Fe3O4納米酶摻雜中的Ca元素進行定性分析。如圖3A所示，作者發(fā)現(xiàn)Ca-Fe3O4擁有Fe3O4的特征譜，但是由于Ca元素的含量很少，沒有顯示出其特征峰。元素定量分析顯示Ca元素摻雜的量為0.057%(原子比)，而在Ca-Fe3O4納米酶和Fe3O4納米酶中鐵的含量基本一致(圖3B、C)。運用動態(tài)光散射技術(shù)檢測了Ca-Fe3O4納米酶表面所攜帶的電荷特征。如圖3D所示, Ca元素摻雜后可以顯著提高Fe3O4納米酶表面的正電荷。表面電荷的多少將會影響納米酶的催化效率，摻雜后改變表面電荷的Ca元素有可能改善納米酶的催化活性。

A. 天然酶HRP中鈣原子;B. 鈣摻雜到Fe3O4納米結(jié)構(gòu)的示意圖;C. SEM分析Fe3O4納米酶摻雜鈣前后的變化;D. TEM分析Fe3O4納米酶摻雜鈣前后的變化

圖1酶催化中的鈣及Fe3O4納米酶鈣摻雜的表征

2.2 鈣摻雜調(diào)節(jié)Fe3O4納米酶催化活性

鈣摻雜降低了Fe3O4納米酶的過氧化物酶活性。作者主要運用酶動力學(xué)反應(yīng)參數(shù)來確定Ca摻雜的Fe3O4納米酶的過氧化物酶活性。Fe3O4納米酶同樣具有與辣根過氧化物酶相似的活性，酸性條件下能催化(TMB)與H2O2發(fā)生顏色反應(yīng)。因為這一反應(yīng)存在2個底物，作者首先分析了針對H2O2為變量的反應(yīng)動力學(xué)過程，即固定納米酶和TMB的濃度，調(diào)整雙氧水的濃度。米氏方程模型數(shù)據(jù)擬合得到的參數(shù)，鈣摻雜前后Fe3O4納米酶的動力學(xué)曲線基本一致(圖4A)。最大反應(yīng)速率Vmax相差不大(圖4B), 親和常數(shù)Km顯著增高, Fe3O4納米酶為(252.70±49.29) mmol/L, 而Ca-Fe3O4納米酶為(316.90±49.79) mmol/L(圖4C)。 以Vmax/Km代表反應(yīng)催化效率，與Fe3O4納米酶相比, Ca-Fe3O4納米酶的過氧化物酶活性降低(圖4D)。

A. 鈣摻雜到Fe3O4納米酶的元素掃描圖像; B. Fe3O4納米酶摻雜鈣前后的元素譜圖2 鈣摻雜的元素掃描分析

其次，作者分析了針對TMB的反應(yīng)動力學(xué)過程，即固定納米酶和雙氧水的濃度，調(diào)整TMB的濃度。鈣摻雜前后Fe3O4納米酶催化動力學(xué)曲線均符合米氏方程(圖5A), 鈣摻雜前后Fe3O4納米酶的最大反應(yīng)速度相差不大, Ca-Fe3O4納米酶略高(圖5B)。但是對TMB的親和力鈣摻雜后降低，反映到親和常數(shù)Km, Ca-Fe3O4納米酶為(0.58±0.07) mmol/L，而Fe3O4納米酶為(0.31±0.05) mmol/L。因此同樣的計以Vmax/Km計算催化效率，鈣摻雜后降低了Fe3O4納米酶過氧化物酶催化活性(圖5D)。Fe3O4納米酶對底物TMB的米氏常數(shù)Km值小，可能與納米顆粒表面的物理和化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，比表面積大，表面電荷豐富，形貌復(fù)雜，容易吸附帶正電的TMB, 造成較高的親和力。而Ca-Fe3O4納米酶表面帶有正電荷，不利于TMB的結(jié)合，因此表觀的催化活性較低。

A. Ca-Fe3O4納米酶和Fe3O4納米酶的XPS對比圖; B. Fe3O4納米酶摻雜鈣前后的鐵原子比例;C. Ca-Fe3O4納米酶中的鈣原子比例; D. Fe3O4納米酶摻雜鈣前后的表面電勢變化

A. Michaelis-Menten反應(yīng)動力學(xué)擬合; B. 最大反應(yīng)速度Vmax比較; C. 親和常數(shù)Km比較; D. 催化效率比較

圖4過氧化物酶活性分析(過氧化氫變量)

鈣摻雜增強Fe3O4納米酶的過氧化氫酶活性。在中性條件下這一催化活性將雙氧水分解為氧氣和水，因此檢測這一反應(yīng)過程主要是根據(jù)溶液中氏方程(圖6A)。但與Fe3O4納米酶相比,Ca-Fe3O4納米酶的最大反應(yīng)速度變大，達到(13.04±0.77) mg/(L·s), 而Fe3O4納米酶為(11.90±0.81) mg/(L·s)溶解氧的含量來進行的。運用溶氧儀來檢測Ca元素對Fe3O4納米酶的過氧化氫酶活性的影響。如圖6所示，整個催化動力學(xué)曲線也符合米氏方程(圖6B)。Km變化更為顯著, Ca-Fe3O4納米酶為(328.80±48.65) mmol/L, 而Fe3O4納米酶為(724.20±95.96) mmol/L。以Vmax/Km計算催化效率則Ca-Fe3O4納米酶增強2倍左右。這些結(jié)果表明摻雜了Ca元素后，納米酶的過氧化氫酶活性得到了改善。

A. Michaelis-Menten反應(yīng)動力學(xué)擬合; B. 最大反應(yīng)速度Vmax比較; C. 親和常數(shù)Km比較; D. 催化效率比較

圖5過氧化物酶活性分析(TMB變量)

A. Michaelis-Menten反應(yīng)動力學(xué)擬合; B. 最大反應(yīng)速度Vmax比較; C. 親和常數(shù)Km比較; D. 催化效率比較

圖6過氧化物氫酶活性分析(雙氧水變量)

2.3 Ca-Fe3O4納米酶的抗病毒效應(yīng)

流感病毒的增殖與細胞水平的氧化應(yīng)激(活性氧, ROS)相關(guān)，而上述Ca-Fe3O4納米酶具有過氧化物酶和過氧化氫酶活性，可以調(diào)節(jié)ROS水平，因此作者推測Fe3O4納米酶可能影響病毒在宿主細胞內(nèi)的生長和繁殖。作者選用了禽流感病毒H3N2-IFV侵染MDCK細胞的實驗?zāi)Ｐ?圖7A), 結(jié)果顯示Ca-Fe3O4納米酶能夠顯著抑制H3N2-IFV在細胞內(nèi)的增殖，血凝測試表明200 μg/mL的Ca-Fe3O4納米酶抑制病毒滴度降低8倍(圖7B)。此外，作者還發(fā)現(xiàn)將Ca-Fe3O4納米酶與H3N2-IFV病毒直接混合作用1 h, 隨后檢測病毒HA效價發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Ca-Fe3O4納米酶處理后病毒效價也可以降低8倍，而Fe3O4納米酶雖然也能降低病毒效價，但效果沒有前者好(圖7C)。這些實驗結(jié)果表明Ca-Fe3O4納米酶不僅具有抑制禽流感病毒胞內(nèi)增殖的作用，還可以直接破壞病毒表明的血凝素，降低病毒的毒力。

A. 納米酶細胞內(nèi)抗病毒示意圖; B. Ca-Fe3O4納米酶抑制細胞內(nèi)流感病毒增殖滴度變化;C. Ca-Fe3O4納米酶直接降低病毒HA效價

圖7鈣摻雜Fe3O4納米酶的抗病毒效應(yīng)

3 討 論

通過參考天然酶中鈣原子的存在形式，作者提出了將鈣摻雜到Fe3O4納米酶中進而調(diào)節(jié)納米酶的催化活性。作者利用水熱法成功將鈣摻雜到Fe3O4納米酶納米結(jié)構(gòu)中，物理化學(xué)表征表明鈣摻雜后沒有顯著改變納米顆粒的尺寸，但使納米顆粒表面形貌粗糙度增加，表面電勢增強。酶反應(yīng)動力分析表明鈣摻雜降低了Fe3O4納米酶的過氧化物酶催化活性，但是增強了過氧化氫酶催化活性。此外，作者發(fā)現(xiàn)鈣摻雜顯著提高了Fe3O4納米酶抗病毒效應(yīng)，不僅可以抑制流感病毒在細胞內(nèi)的增殖，還能直接破壞病毒的效價。這些研究初步表明，鈣摻雜可以調(diào)節(jié)Fe3O4納米酶的催化活性，并且增強其抗病毒作用。