熊軍波，劉 洋，田 宏，張鶴山，陳明新

(湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是全球栽培面積最大的多年生豆科牧草，具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等特性，是公認的“牧草之王”。紫花苜蓿適宜生長在中性偏堿性的土壤環(huán)境中，具有中等耐鹽堿性，在電導率為0.0～2.0 dS/m的鹽堿性土壤中能正常生長，超過此范圍，電導率每上升1 dS/m，產(chǎn)量下降7%[1]。根據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(food and agriculture organization，F(xiàn)AO)的估算，全世界約有3 400萬hm2(灌溉面積的11%)受到不同程度的鹽漬化影響[2]。據(jù)國家農(nóng)業(yè)部組織的第2次全國土壤普查資料統(tǒng)計，我國現(xiàn)有鹽漬土的面積為3 467萬hm2(不包括濱海灘涂)，其中已開墾種植的為576.8萬hm2。如何提高紫花苜蓿在鹽堿土壤中的產(chǎn)量，一直是國內(nèi)外苜蓿工作者關注的重點。

土壤鹽堿化是由一系列離子共同構成的，包括NaCl、Na2SO4、MgSO4、CaSO4、MgCl2、KCl和Na2CO3等，NaCl是最主要的鹽分構成，目前大部分研究都是圍繞NaCl脅迫展開的[3-4]。高濃度的NaCl會引起植物水分缺失、離子毒害、營養(yǎng)失衡、氧化脅迫等，而導致植物生長減緩，甚至死亡[5]。生理生化研究表明，紫花苜蓿通過形態(tài)學改變、加強活性氧清除、合成滲透物、離子選擇吸收、隔離和外排、改變細胞壁和細胞膜結構等措施以適應鹽脅迫[6]。這些適應性調(diào)節(jié)機制與鹽脅迫下紫花苜?；蚓W(wǎng)絡的特異性表達密切相關，采用各種高通量技術，已經(jīng)鑒定出大量鹽脅迫響應基因[7-8]。這些研究從轉錄組水平初步揭示了苜蓿響應鹽脅迫的代謝網(wǎng)絡，然而基因從轉錄到最后表達成蛋白行使功能，中間受到復雜的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)的亞細胞定位、蛋白-蛋白相互作用等調(diào)控，因此非常有必要從蛋白質(zhì)水平進行深入研究。

蛋白質(zhì)組學從整體角度分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律的一個新的研究領域。近年來，國內(nèi)外研究者采用蛋白質(zhì)組學方法對超過34種植物的葉片、根、莖、幼苗、單細胞、種子、子葉下胚軸、花序等組織響應鹽脅迫的蛋白質(zhì)組進行研究，成功鑒定出超過 2 171個鹽脅迫響應蛋白質(zhì)[9]。本研究擬選取耐鹽紫花苜蓿品種中苜1號為材料，使用雙向電凝膠電泳(2-DE)和質(zhì)譜鑒定技術對紫花苜蓿幼苗地上部(莖葉)在響應鹽誘導時差異表達蛋白進行篩選和鑒定，采用生物信息學方法對差異蛋白的功能和參與的代謝途徑進行分析，以期尋找到紫花苜蓿響應鹽脅迫應答機制中存在組織異性的調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫花苜蓿中苜一號種子由中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所牧草研究室提供。挑選籽粒飽滿、無病蟲害的種子，用1%次氯酸鈉溶液消毒5 min，然后用蒸餾水沖洗3次。清洗的種子用蒸餾水浸種12 h后，放置于濕潤的濾紙中培養(yǎng)3 d。之后將幼苗移入1/2 Hoagland營養(yǎng)液中進行水培，6 d后開始脅迫。將培養(yǎng)的幼苗分為2組：一組在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)；另一組在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中添加50 mmol/L NaCl適應生長24 h，其后放入濃度為200 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)。每2 d更換1次培養(yǎng)液，其間不定時攪拌，培養(yǎng)9 d后同時收割2組苜蓿地上部(莖葉)，液氮保存。

1.2 藥品與試劑

固相pH值梯度干膠條、IPG緩沖液、雙向電泳蛋白洗滌液(2D clean-up)試劑盒、雙向電泳蛋白質(zhì)定量(2D-quant)試劑盒、尿素(urea)、甘氨酸、兩性表面活性劑(CHAPS)、丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺(bis-acrylamide)、過硫酸銨(AP)、干膠條覆蓋液(礦物油)，均購自Amersham Biosciences；碘乙酰胺、二硫蘇糖醇(DTT)、四甲基乙二胺(TEMED)購自Sigma公司；溴酚藍、蛋白marker、碳酸鈉、乙酸鈉、硫代硫酸鈉、EDTA二鈉鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)、低熔點瓊脂糖購自BBI(Bio Basic Inc，加拿大)；其他試劑為國產(chǎn)分析純。所有溶液均用Milli-Q制備的純水配制。

1.3 總蛋白質(zhì)的提取和定量

蛋白質(zhì)提取參照Xiong等的方法[10]，部分進行調(diào)整。稱取0.5 g樣品加入液氮研磨后，轉入離心管加入3 mL TRIzol(2% DTT)，振蕩混勻，加入0.6 mL三氯甲烷，振蕩混勻，放置 5 min；4 ℃、15 000 r/min離心10 min，去上清，添加 0.9 mL 無水乙醇，振蕩混勻，放置5 min；4 ℃、15 000 r/min離心5 min，取上清，加入4.5 mL異丙醇，振蕩混勻，4 ℃放置5 min；此后4 ℃、15 000 r/min離心10 min，去上清，用6 mL含 300 mmol/L 鹽酸胍的95%乙醇洗滌沉淀3次；4 ℃、15 000 r/min 離心10 min，留沉淀，用6 mL無水乙醇洗滌1次，冷凍干燥。其后加入裂解液[8 mol/L尿素、20 mg/mL CHAPS、10 mg/mL DTT、0.5% IPG緩沖液(pH值為4～7)和0.02 mg/mL溴酚藍，超聲20 min促溶，4 ℃靜置4 h以上，離心沉淀(4 ℃、40 000 r/min)1 h，吸取上清備用。使用2D-quant試劑盒對蛋白質(zhì)進行定量分析，步驟按試劑盒說明進行。

1.4 等電聚焦電泳和SDS-PAGE電泳

使用水化液[8 mol/L尿素、20 mg/mL CHAPS、10 mg/mL DTT、0.5% IPG緩沖液(pH值4～7)和0.02 mg/mL溴酚藍]稀釋蛋白質(zhì)溶液，最終將0.27 mg/mL蛋白質(zhì)溶液上樣到 24 cm、pH值4～7的IPG膠條上。等電聚焦在Ettan IPGphor Ⅱ(GE Healthcare)儀器上進行，溫度設置為20 ℃，程序為：30 V，12 h；150 V，1 h；500 V，1 h；1 000 V，1 h；8 000 V，2 h；8 000～40 000 V·h。等電聚焦后膠條立即平衡，首先在含有平衡液[6 mol/L尿素、300 mg/mL甘油、20 mg/mL SDS、50 mmol/L Tris-HCl，pH值8.8，10 mg/mL DTT]的平衡液管中水平放置15 min，其后換入含有平衡液的管中水平放置 15 min。平衡后的膠條轉移到12% SDS-PAGE凝膠中進行二向分離，首先在電泳液(250 mmol/L Tris-base、1.92 mol/L甘氨酸和 10 mg/mL SDS)中0.2 W/膠條運行1 h，其后相同環(huán)境中使用15 W/膠條運行到結束。每組試驗設置4次組內(nèi)重復。

1.5 蛋白染色和圖像分析

凝膠選用銀染，方法參照GE handbook作適當修改。凝膠首先在含有40%乙醇、10%乙酸的水溶液中固定1 h，其后使用含有30%乙醇、2 mg/mL硫代硫酸鈉和6.8%乙酸鈉溶液中敏化30 min。經(jīng)超純水漂洗3次，每次5 min；后轉入含有2.5 g/L硝酸銀溶液中銀染20 min，其后使用超純水漂洗2次，每次1 min；轉入顯色液(25 g/L碳酸鈉、240 mL/L 甲醛)中顯色2次：第1次1 min，第2次4 min。反應完后轉入含有1.46% EDTA的溶液中10 min終止反應，最后使用純水漂洗3次，每次5 min。染色完成的膠用Powerlook 2100XL掃描儀掃描，并使用ImageMasterTM2D Platinum 6.0軟件分析，包括凝膠圖像的背景消除、點確認、定量和點的匹配等，選取蛋白質(zhì)相對表達量差異達2倍以上的蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜分析。

1.6 蛋白質(zhì)譜鑒定

根據(jù)ImageMaste分析軟件結果挖取差異蛋白質(zhì)點，委托華大基因進行基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF/MS)分析。將所得到的肽片段質(zhì)量數(shù)據(jù)運用MASCOT軟件進行在線檢索(http：//www.matrixscience.com)，選取NCBI數(shù)據(jù)庫作為檢索數(shù)據(jù)庫。鑒定成功的蛋白質(zhì)點根據(jù)aimGo數(shù)據(jù)庫(http：// www.geneontology.org/)功能注釋進行分類統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 雙向電泳凝膠圖譜分析和質(zhì)譜鑒定

分別提取對照組和處理組地上部分蛋白質(zhì)進行雙向電泳，電泳圖譜見圖1。基于ImageMaster圖像軟件分析，每張 2-DE膠上約可檢測到900多個蛋白質(zhì)點，其中對組照凝膠上(0 mmol/L NaCl)凝膠上有(907±31)個蛋白質(zhì)點，而處理組(200 mmol/L NaCl)凝膠上有(914±23)個蛋白質(zhì)點，2個試驗組內(nèi)變異系數(shù)都在5%以內(nèi)。對其蛋白質(zhì)點分布分析表明，大多數(shù)蛋白質(zhì)點集中在等電點為5～7，分子量為38～90 ku。軟件匹配和手工匹配相結合，2種處理的蛋白質(zhì)匹配成對的有817對。豐度分析表明，有20個蛋白質(zhì)點相對豐度發(fā)生2倍以上變化，可以重復，蛋白質(zhì)點輪廓清晰可見，同時在分析時去掉了可能的生物學影響及膠本身的影響。其中13個在鹽脅迫下表達量下調(diào)，7個表達量上調(diào)。差異表達蛋白質(zhì)點廣泛分布于雙向圖譜中，部分蛋白質(zhì)點局部見圖2。

2.2 差異表達蛋白的質(zhì)譜分析和功能分類

選取全部差異表達蛋白進行MALDI-TOF-TOF/MS分析，Mascot軟件搜索NCBInr和SWISSPROT數(shù)據(jù)庫GreenPlants進行匹配，14個匹配成功(表1)?；赼imGo數(shù)據(jù)庫功能注釋，將這些蛋白的功能分為以下幾類：Ⅰ類，參與光合作用蛋白。共4個蛋白質(zhì)，包括1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基(編號4)、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基(編號3)、苯醌質(zhì)體藍素還原酶(編號13)、葉綠體放氧增強蛋白1(OEE1，編號5)。Ⅱ類，脅迫防御類蛋白。共2個蛋白，包括谷胱甘肽過氧化物酶1(編號9)和抗病相關蛋白2(編號7)。Ⅲ類，碳水化合物代謝相關蛋白。共2個蛋白，包括3-磷酸甘油醛脫氫酶(編號12)和蔗糖合酶(編號1)。Ⅳ類，轉錄調(diào)控和信號傳導相關蛋白。共2個蛋白，包括液泡的鈣結合相關蛋白(編號14)和真核翻譯起始因子5A-2(編號8)。Ⅴ類，生長發(fā)育調(diào)控蛋白。共2個蛋白，包括細胞分裂周期蛋白48(編號11)和F-box家族蛋白(編號10)。Ⅵ類，次生代謝相關蛋白。共2個蛋白，包括硫腺苷甲硫氨酸和酶(編號6)和丙二烯氧化環(huán)化酶2(編號2)。

表1 鹽脅迫下紫花苜蓿差異表達蛋白的串聯(lián)質(zhì)譜鑒定結果

續(xù)表1

編號匹配蛋白名稱(物種)NCBI登錄號理論分子量Ku/等電點測定分子量Ku/等電點得分匹配肽段數(shù)(個)相對表達量7抗病相關蛋白2(PR2)[紫花苜蓿]2226600116.5/5.836/6.834448真核翻譯起始因子5A-2(eIF-5A-2)[海島棉]4564451017.2/5.235/4.5112311細胞分裂周期蛋白48(CDC48)[擬南芥]184149390.6/5.034/4.940761蔗糖合酶(SS)[紫花苜蓿]316954492.6/5.820/4.375310F-box家族蛋白[擬南芥]1523626658.2/9.6886.0984

注：“相對濃度”一欄中，1表示對照，2表示處理。

3 討論

3.1 光合作用和碳水化合物代謝相關蛋白質(zhì)

鹽脅迫下，植物的光合作用首先受到影響[11]。在鑒定的差異表達蛋白中有4個蛋白參與到光合作用過程中，其中苯醌質(zhì)體藍素還原酶(PPR)和放氧增強蛋白1(OEE1)參與光合作用中的光反應階段。OEE1是光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)中放氧復合體的2個亞基之一，靠近類囊體腔的一側，參與水的裂解和氧的釋放[12]。體外試驗也證實了OEE1能催化水氧化為氧分子，且當OEE1表達量下降時，PSⅡ的活性下降16%～40%[13]。PPR參與質(zhì)體藍素的合成，質(zhì)體藍素為細胞色素復合體與PSⅠ之間的電子傳遞中介受體[14]。在本研究中2個光反應相關蛋白表達量下降，必將導致光反應向暗反應提供能量的減少。研究還發(fā)現(xiàn)，暗反應關鍵調(diào)節(jié)酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCO)大小2個亞基表達量發(fā)生變化。RuBisCO催化暗反應的碳固定，將大氣中游離的CO2轉化為生物體內(nèi)儲能分子，同時也是光呼吸催化酶。高等植物中RuBisCO是由8個大亞基和8小亞基組成的寡聚體，在植物葉片內(nèi)的含量很高，約占可溶性蛋白質(zhì)的50%以上[15]。有研究表明，RuBisCO亞基表達量改變與活性氧導致的RuBisCO的降解相關[16]。

鹽脅迫下，植物水分吸收受阻，為了減少水分蒸發(fā)，植物通過減小葉片面積、關閉氣孔以適應鹽脅迫環(huán)境。葉片面積減少會導致光反應速率受到影響，在本研究中鑒定的光反應相關蛋白表達量下降，與這些生理現(xiàn)象相關。同時，氣孔的閉合將直接導致CO2的吸收和同化減少，RuBisCO的降解必然會導致碳素化合物合成減少，而對后續(xù)的碳水化合物正常生理代謝產(chǎn)生影響。在本研究中發(fā)現(xiàn)蔗糖合成酶(SS)與甘油醛-3-磷酸酶(GAPDH)2個參與碳水化合物代謝的酶表達量下降。其中，SS是植物體內(nèi)蔗糖合成和分解的關鍵酶，直接調(diào)控蔗糖在由“源”向“庫”的運輸，同時也是蔗糖進入各種代謝途徑的關鍵酶[17-18]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)是高等植物糖酵解、糖異生和卡爾文循環(huán)過程中的關鍵酶，催化甘油醛-3-磷酸形成1，3-二磷酸甘油酸的可逆反應，是糖酵解(糖異生)中唯一的氧化(還原)反應，催化依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP+)，將3-磷酸甘油醛氧化為3-磷酸甘油酸，同時伴有還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)生成的不可逆反應[19]。這2個蛋白質(zhì)表達量的下降，進一步表明鹽脅迫對碳水化合物的合成代謝產(chǎn)生影響。

3.2 脅迫防御蛋白相關蛋白質(zhì)

當植物在受到真菌、細菌和病毒等病原體入侵或受到非生物脅迫時會產(chǎn)生和積累病程相關(PR)蛋白，PR蛋白的誘導已在多種植物中發(fā)現(xiàn)，它是植物自我防御機制中的可誘導組分。PR蛋白根據(jù)其作用和功能分為17個家族，其中PR2蛋白屬于β-1，3-葡聚糖酶家族，其以探明的功能包括水解真菌性病原菌的細胞壁，參與植物生長發(fā)育的各個階段的調(diào)控[25]。在本研究中鹽脅迫下莖葉中PR2蛋白表達量上升，在此前的研究中還未發(fā)現(xiàn)該蛋白響應鹽脅迫的誘導。

3.3 次生代謝相關蛋白質(zhì)

本研究中鑒定出5-腺苷甲硫氯酸合成酶(SAMS)和丙二烯氧化環(huán)化酶2(AOC2) 2個參與到激素合成次生代謝蛋白表達量發(fā)生改變。其中，SAMS參與催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的生物合成，而SAM是植物體內(nèi)一個普遍的甲基供體，也是乙烯生物合成的前體。對SAMS的研究表明其在植物逆境生理、衰老生理、植物生物代謝及其調(diào)控研究上均具有重要的意義。在本研究中SAMS蛋白質(zhì)表達量下降，這與此前在擬南芥根中的研究結果[26]一致。丙二烯氧化環(huán)化酶2(AOC2)是茉莉酸(jasmonic acid，JA)合成前體，植物JA作為一種信號分子，參與誘導氣孔關閉，抑制Rubisco生物合成，影響植物對N、P的吸收，葡萄糖等有機物的運輸以及生物脅迫的應急反應調(diào)控等[27]。對AOC基因功能研究表明，在番茄中轉入外源的AOC能提高其抗鹽堿能力[28]。此前研究還表明，在鹽脅迫條件下，該蛋白質(zhì)在耐鹽植物鹽芥中表達量上升，而在敏鹽植物擬南芥中表達量下降，表明該蛋白質(zhì)的表達量可能與耐鹽調(diào)節(jié)相關[29-30]。在本研究中AOC2蛋白質(zhì)表達量上升，可能對紫花苜蓿耐鹽調(diào)節(jié)有重要作用。

3.4 轉錄調(diào)控和信號傳導相關蛋白質(zhì)

植物感受到外界環(huán)境刺激，通過特定的受體將這一信號傳遞到細胞核，并誘導相關基因的表達來適應外界環(huán)境，此過程受到復雜的轉錄、翻譯和剪切修飾等調(diào)控。Ca2+是植物體內(nèi)重要的信號分子，在受到多種脅迫時都會誘導細胞基質(zhì)中鈣離子濃度變化(Δ[Ca2+]cyt)，特定的膜聯(lián)蛋白質(zhì)(annexins)通過結合Δ[Ca2+]cyt而進行信息傳遞[31]。Δ[Ca2+]cyt濃度的增加被一種鈣依賴磷酸酶(calcineurin B-like protein CBL4)所感應，通過磷酸化激活特定的蛋白質(zhì)，從而啟動到后續(xù)調(diào)節(jié)反應。此后，[Ca2+]cyt由通過Ca2+通道、Ca2+結合蛋白對鈣的緩沖等降低細胞基質(zhì)中Ca2+含量。在本研究中液泡鈣離子結合相關蛋白質(zhì)(vacuolar calcium-binding protein-related)在Ca2+通道中起到緩沖[Ca2+]cyt的作用，在鹽脅迫下表達量上調(diào)。

eIF-5A為真核細胞蛋白轉譯起始因子，普遍存在于真核生物和原始細菌中。研究表明，它是目前自然界中唯一一種含有特殊氨基酸8-羥基2,7,10-三氨基癸酸(hypusine)的蛋白質(zhì)，eIF-5A只有通過hypusine化修飾后才能行使其功能，與經(jīng)典的轉錄起始因子不同的是，eIF-5A并非所有蛋白質(zhì)翻譯所必需的因子[32]。研究還證實，eIF-5A與細胞中的許多生命活動有關，如細胞增殖、蛋白質(zhì)翻譯、mRNA降解、細胞周期的轉化及細胞衰老與凋亡等[33]。對擬南芥eIF-5A家族成員的分析表明，不同家族成員參與的轉錄調(diào)控與植物的不同生理防御相關，其中eIF-5A-2參與擬南芥受到病毒感染和傷害后的信號傳導，并通過細胞分裂素信號通路調(diào)控擬南芥根木質(zhì)部的發(fā)育，在細胞的分裂、生長和死亡中發(fā)揮著重要作用[34]。本研究中eIF-5A-2表達量下降，表明該蛋白質(zhì)也參與到鹽脅迫調(diào)節(jié)中。

3.5 生長發(fā)育調(diào)控相關蛋白質(zhì)

泛素-蛋白酶途徑在細胞周期控制、晝夜節(jié)律、花的發(fā)育和激素信號轉導等許多細胞過程中都發(fā)揮著關鍵作用。在該途徑中，泛素標記單細胞發(fā)育過程中不需要的蛋白質(zhì)被蛋白酶26S降解，從而調(diào)控細胞的發(fā)育和分化[35]。本研究鹽脅迫下，莖葉中1個F-box家族蛋白和1個細胞分化周期蛋白質(zhì)表達量都下降，且都與泛素-蛋白酶途徑相關。F-box家族蛋白質(zhì)通過與Skp1p-cullin結合形成Skp1p-cullin-Fbox (SCF)蛋白質(zhì)復合體，該復合體蛋白質(zhì)能識別目標降解蛋白質(zhì)，從而調(diào)控細胞分化、細胞周期、轉錄調(diào)控和信號傳導等過程[36]。在植物體中，CDC48蛋白質(zhì)參與紡錘體的分解、泛素結合蛋白質(zhì)的分解和蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜到細胞質(zhì)的運輸[37-38]。鹽脅迫下，苜蓿的生長發(fā)育減緩，這2個蛋白質(zhì)表達量的下降也反映了該生理過程。

4 結論

差異蛋白質(zhì)組學通過比較植株細胞在不同生理調(diào)節(jié)下蛋白質(zhì)的差異表達，對相關蛋白質(zhì)進行鑒定和分析，從蛋白質(zhì)組學水平揭示植物在適應脅迫環(huán)境中的調(diào)節(jié)機制。本研究將差異蛋白質(zhì)組學技術運用于紫花苜蓿鹽脅迫適應機制的研究中，分別提取對照和鹽脅迫環(huán)境中紫花苜蓿地上部蛋白質(zhì)，應用雙向電泳技術進行分離，通過雙向電泳太圖譜分析軟件分析，獲得圖譜中20個點豐度發(fā)生2倍以上變化，采用串聯(lián)質(zhì)譜成功鑒定出14個差異表達蛋白質(zhì)，應用生物信息學方法并結合植物生理學，對這些差異蛋白所參與的代謝途徑及其作用機理進行分析。結果表明，這些蛋白質(zhì)主要參與光合作用、脅迫防御應答、碳水化合物代謝、轉錄調(diào)控和信號傳導、細胞分化和次生代謝。