石靈玉，馬 淼，2

(1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003； 2.石河子大學(xué)甘草研究所，新疆石河子 832003)

許多礦質(zhì)元素是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的，參與著許多重要的新陳代謝活動(dòng)[1]，其數(shù)量不足會(huì)使植物的生長(zhǎng)或繁殖受阻[2]。然而，環(huán)境中的礦質(zhì)元素如果過量，也會(huì)對(duì)其中的植物造成脅迫[3]，甚至傷害。土壤鹽漬化就是由于某些礦質(zhì)元素過量造成的，尤其是過量的Na+會(huì)破壞土壤的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)[4]、影響植物對(duì)K+的吸收[5]、破壞質(zhì)膜的K+/Na+平衡[6]等。鹽生植物作為在鹽漬土上唯一能夠生存的植被類型，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了拒鹽、聚鹽、泌鹽和稀鹽等有成效的鹽分適應(yīng)機(jī)制[7]，使其能在鹽土中正常生長(zhǎng)。

烏拉爾甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)是豆科(Leguminosae)甘草屬(Glycyrrhiza)多年生草本植物，是中藥材甘草的原植物之一[8]。以根和根狀莖入藥，具有抗炎[9]、抗過敏、抗病毒[10]、抗癌[11]、抗輻射[12]等療效，所以備受醫(yī)藥界的重視。甘草的適應(yīng)性很廣，常分布于田間、路旁及鹽湖周圍的鹽化生境，被認(rèn)為是一種拒鹽的鹽生植物[13]。然而，筆者所在課題組前期的野外研究發(fā)現(xiàn)，生活在鹽化低地草甸中的烏拉爾甘草葉片表面有分泌鹽分的習(xí)性[14]，大量的鹽分通過鹽腺和氣孔分泌到了葉片表面(圖1-A至圖1-F)。說明烏拉爾甘草并非是拒鹽植物，其根系會(huì)從土壤中吸收大量鹽分，并通過葉片將多余部分排出體外，應(yīng)當(dāng)是一種泌鹽植物。然而，其不同部位的葉片間是否存在泌鹽能力的差異，葉內(nèi)較高濃度的鹽分是否會(huì)對(duì)葉片造成脅迫傷害，以及葉片是如何適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境的等問題卻一直未見研究報(bào)道，故本研究以生長(zhǎng)在高鹽環(huán)境中的野生烏拉爾甘草為研究對(duì)象，比較了其不同部位葉片的泌鹽能力，可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等保護(hù)酶的活性，以期為烏拉爾甘草耐鹽機(jī)制的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣地和材料

烏拉爾甘草樣地選自新疆阿勒泰地區(qū)的鹽化低地草甸，屬于溫帶大陸性氣候，冬季漫長(zhǎng)而寒冷，夏季短促、氣溫平和，全年無霜期平均為151 d，最冷月為1月，平均氣溫為 -16 ℃，最熱月7月，平均氣溫為21 ℃，年平均降水量為 200 mm。樣地中的烏拉爾甘草種群生活在極端高鹽的土壤環(huán)境中，地表白色鹽分的厚度超過了5 cm，0～10 cm土層的電導(dǎo)率值為8.49 dS/m，pH值為10.33。然而烏拉爾甘草長(zhǎng)勢(shì)良好，開花結(jié)實(shí)率正常(圖1-A)，野外試驗(yàn)在2016年7月進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 烏拉爾甘草不同部位葉片泌鹽性能的比較

1.2.1.1 甘草不同部位葉片腺體和氣孔泌鹽的觀察 選取開闊地烏拉爾甘草植株，依株高平均分為上、中、下3段，取上部、中部和下部健康的完全展開葉若干，將近葉尖1/3處葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小塊(過主脈)，置于甲醛-乙酸-乙醇固定液(FAA)中固定 48 h，之后將固定好的材料粘在樣品臺(tái)上，進(jìn)行離子濺射鍍金，鍍金后的材料放在掃描電子顯微鏡(SU8010)下進(jìn)行觀察并拍照，重復(fù)測(cè)量5個(gè)材料，觀察烏拉爾甘草上部、中部、下部葉片泌鹽的情況。在600×視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野中的腺體和氣孔總數(shù)以及泌鹽腺體和泌鹽氣孔的數(shù)量，計(jì)算泌鹽腺體和泌鹽氣孔的百分?jǐn)?shù)，取平均值。

1.2.1.2 甘草不同部位葉片表面淋溶物Na+和K+的含量 將開闊地烏拉爾甘草植株依株高平均分為上部、中部、下部，從不同部位葉片中隨機(jī)選取15張完全展開的葉片，3個(gè)重復(fù)。用去離子水將葉片上下表面清洗干凈，做好標(biāo)記。7 d后，用潔凈的毛筆蘸去離子水再次刷洗標(biāo)記過的葉片，將葉片表面的分泌物淋洗并收集，定容至10 mL。用ICP(thermo scientific icap 6000 serirs，USA)測(cè)定淋溶物中Na+和K+的含量，依次對(duì)不同部位葉片的泌鹽性能進(jìn)行比較。

1.2.2 烏拉爾甘草不同部位葉片生理指標(biāo)的測(cè)定 取烏拉爾甘草上部、中部、下部葉片若干，測(cè)定可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸、MDA含量和SOD、POD、CAT活性等生理生化指標(biāo)，每個(gè)部位葉片重復(fù)測(cè)量3次，結(jié)果取均值。可溶性糖、MDA、脯氨酸(Pro)含量測(cè)定參考《現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[15]?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定[16]。SOD、POD、CAT活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 19.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan’s多重比較檢測(cè)不同處理間的差異顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏拉爾甘草不同部位葉片泌鹽性能的比較

通過掃描電鏡觀察烏拉爾甘草葉片，發(fā)現(xiàn)葉片表面氣孔和腺體均有泌鹽的現(xiàn)象(圖1-D至圖1-F)。且不同部位葉片鹽分分泌情況存在顯著差異，上部葉片氣孔通透，其中未見鹽分積累；下部葉片氣孔的泌鹽性能強(qiáng)烈，所有氣孔中都堆積有大量的鹽分，部分氣孔已經(jīng)被鹽分完全堵塞；而中部葉片只有78%的氣孔有泌鹽現(xiàn)象，且泌鹽性能微弱，氣孔中僅有少量鹽分積存(表1、圖1-G至圖1-I)。不同部位葉片的鹽腺都有泌鹽現(xiàn)象，且視野中100%的鹽腺都分泌了鹽分，但不同部位葉片鹽腺泌鹽程度存在差異，上部葉片泌鹽量少，中部和下部葉片分泌了大量的鹽分。

表1 烏拉爾甘草不同部位葉片氣孔和腺體的泌鹽狀況比較

注：“-”表示無鹽分分泌，“+”表示有少量鹽分分泌，“++”表示有大量鹽分分泌。

收集葉片表面分泌物，對(duì)葉片表面淋溶物中Na+和K+的含量進(jìn)行測(cè)定(圖2)，結(jié)果顯示，雖然不同部位葉片均有泌鹽的功能，但上部葉片的泌鹽功能微弱，下部葉片分泌的Na+的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于上部和中部葉片，約為上部葉片分泌量的9倍和中部葉片分泌量的12倍；下部葉片分泌的K+的量約為上部葉片分泌量的4.7倍和中部葉片的3.8倍。說明烏拉爾甘草葉片的鹽分分泌主要是靠下部葉片來實(shí)現(xiàn)的。

2.2 烏拉爾甘草上部、中部、下部葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的比較

滲透調(diào)節(jié)是植物在逆境下降低滲透勢(shì)和維持一定膨壓、抵御逆境脅迫的一種重要方式，可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)及脯氨酸(Pro)是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。從圖3至圖5可以看出，烏拉爾甘草上部、中部、下部葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量存在顯著性差異(P<0.05)。甘草上部嫩葉可溶性糖含量最少，下部葉片可溶性糖含量最高，中部葉片含量適中。烏拉爾甘草葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量以及脯氨酸含量與可溶性糖含量趨勢(shì)相同。

2.3 烏拉爾甘草上部、中部、下部葉片保護(hù)酶活性的比較

作為生物體內(nèi)重要的活性氧清除酶，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)在消除超氧化物自由基、減輕脂質(zhì)過氧化作用和膜傷害方面起重要作用[18]，是酶促防御系統(tǒng)(即保護(hù)酶系統(tǒng))的重要組成成分。

從圖6至圖8可以看出，烏拉爾甘草不同部位葉片中抗氧化物酶活性也存在著差異。甘草下部葉片POD活性顯著高于上部和中部的葉片，存在顯著性的差異(P<0.05)，而上部和中部葉片的POD酶活性沒有顯著性的差異(P>0.05)。葉片中SOD、CAT酶活性的趨勢(shì)相同，且這2種酶活性在不同部位葉片間存在顯著性的差異(P<0.05)，即上部葉片酶活性最低，下部葉片酶活性最高，中部葉片適中。

2.4 烏拉爾甘草上部、中部、下部葉片丙二醛(MDA)含量的比較

MDA是生物膜氧化的產(chǎn)物，它的含量可以作為植物受到脅迫傷害程度的重要指標(biāo)。從圖9中可以看出烏拉爾甘草下部葉片MDA含量最多，中部葉片次之，上部葉片MDA含量最少，且不同部位葉片間MDA含量存在顯著性的差異(P<0.05)。甘草不同部位葉片MDA的含量不同，說明不同部位葉片受到鹽分脅迫的程度不同。

3 討論

葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，與周圍環(huán)境關(guān)系密切，對(duì)生境條件的反應(yīng)最為敏感，是與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)和能量交換的主要器官，因此植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)也較多地反映在葉片上[19]。泌鹽是植物重要的耐鹽機(jī)制之一，目前已有的研究證據(jù)表明泌鹽結(jié)構(gòu)包括腺毛、鹽腺、囊泡以及葉片表面的蠟質(zhì)層[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期生活在高鹽環(huán)境下的烏拉爾甘草葉片具有泌鹽現(xiàn)象，除了通過鹽腺分泌鹽分之外，還采用了以氣孔泌鹽的獨(dú)特方式來適應(yīng)高鹽的土壤環(huán)境。

烏拉爾甘草上部葉片分泌鹽分的能力較弱，葉片受鹽分脅迫程度低，而下部葉片具有旺盛的鹽分分泌能力，葉片受到高鹽分脅迫，中部葉片泌鹽能力及葉片受到鹽分脅迫程度適中。滲透調(diào)節(jié)是植物抵抗逆境脅迫的一種重要生理機(jī)制，植物可以通過滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累以及自身的滲透調(diào)節(jié)作用來維持正常的代謝活動(dòng)[22]。其中含糖量的高低可以反映植物的抗脅迫能力，可溶性糖作為可溶性小分子化合物，可直接被利用或參與滲透調(diào)節(jié)作用，是逆境條件下植物的主要滲透調(diào)節(jié)劑[23]。烏拉爾甘草上部嫩葉可溶性糖含量最少，下部葉片可溶性糖含量最高，說明甘草下部葉片的高鹽分脅迫促使下部葉片可溶性糖含量的增加，使甘草葉片具有較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力，從而增強(qiáng)對(duì)逆境的適應(yīng)。在滲透脅迫時(shí)，植物細(xì)胞可以通過脯氨酸積累量的增加提高胞質(zhì)濃度，保持滲透平衡，防止細(xì)胞過度失水[24]，可溶性蛋白質(zhì)也是植物細(xì)胞質(zhì)中的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，可通過主動(dòng)積累來降低滲透勢(shì)[25]。研究結(jié)果表明，烏拉爾甘草下部葉片脯氨酸含量和可溶性蛋白質(zhì)含量都顯著高于上部和中部葉片，提高了老葉的抗鹽性和保水性。

MDA含量高低可作為耐鹽性高低的生理指標(biāo)[29]，隨著脅迫程度的提高，MDA含量升高。研究表明，烏拉爾甘草不同部位葉片內(nèi)部受到鹽分脅迫的程度存在差異，致使不同部位葉片中的丙二醛含量差異顯著。下部葉片MDA含量最高，鹽脅迫加劇了甘草葉片膜脂過氧化水平，降低膜的選擇透性，膜受到了一定的損傷，而上部和中部葉片中MDA含量相應(yīng)較低，鹽脅迫對(duì)膜系統(tǒng)的破壞較小。

4 結(jié)論

綜上所述，生長(zhǎng)在高鹽環(huán)境下的烏拉爾甘草葉片具有泌鹽的現(xiàn)象，且不同部位葉片泌鹽能力差別顯著，受鹽分脅迫的程度亦顯著不同。下部葉片的鹽分分泌量最大，受鹽脅迫程度最高。烏拉爾甘草葉片通過排出多余鹽分，提高脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)等滲透物質(zhì)的含量以及SOD、POD和CAT等保護(hù)酶的活性來適應(yīng)高鹽環(huán)境，以減輕鹽分對(duì)植物的傷害，使烏拉爾甘草種群能夠在高鹽環(huán)境中正常生長(zhǎng)。