周銀麗，郭建偉，楊 偉，胡先奇

(1.紅河學(xué)院/云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南蒙自 661100； 2.紅河學(xué)院商學(xué)院，云南蒙自 661100；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)/農(nóng)業(yè)生物多樣性與病害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650201)

云南省蒙自市擁有“中國(guó)石榴之鄉(xiāng)”的美譽(yù)[1]，然而隨著石榴栽培的集約化和樹(shù)齡的增長(zhǎng)，各種石榴病害也日益嚴(yán)重，其中被果農(nóng)稱(chēng)為石榴癌癥的枯萎病尤其嚴(yán)重。作為土傳真菌病害的石榴枯萎病，其病原菌甘薯長(zhǎng)喙殼菌(CeratocystisfimbriataEllis. and Halsted)分布廣泛，在我國(guó)主要引起芋頭黑腐病、甘薯黑斑病、石榴枯萎病等[2-4]。根部傷口是石榴枯萎病病菌的主要入侵通道[5-6]，病害果園再植石榴難以成活，石榴園面積在不斷減少，主要原因是多年生果園連作障礙、土壤中有害病原菌的增加及根際微生物區(qū)系失衡關(guān)系密切。

根際微生態(tài)是植物-土壤-微生物及其環(huán)境相互作用的特殊系統(tǒng)，因此，協(xié)調(diào)三者之間的關(guān)系可能是解決連作障礙的關(guān)鍵問(wèn)題。而有益根際微生物可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，對(duì)植物健康生長(zhǎng)起著關(guān)鍵作用。研究根際微生物多樣性的方法較多，其中Biolog ECO微孔板法通過(guò)檢測(cè)微生物細(xì)胞利用不同碳源進(jìn)行呼吸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧化還原物質(zhì)與顯色物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致的顏色變化，即用吸光度的變化來(lái)反映不同類(lèi)型土壤細(xì)菌群落的代謝特征及微生物群落的功能多樣性。Biolog ECO微孔板法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、分辨力強(qiáng)，現(xiàn)已被大量用于土壤微生物多樣性的研究。

本研究利用Biolog ECO微孔板法，分別選取枯萎病石榴根際土壤、健康石榴根際土壤、栽種桃樹(shù)修復(fù)6年的枯萎病土壤、栽種桃樹(shù)修復(fù)8年的枯萎病土壤、裸地土壤，分析5種土壤微生物群落對(duì)31種碳源利用的代謝能力，以期闡明不同類(lèi)型土壤微生物群落碳代謝多樣性的變化規(guī)律，從微生物群落碳代謝多樣性角度解析生物多樣性修復(fù)石榴園連作障礙土壤的可能性。

1 材料與方法

1.1 根際土壤樣品的采集

石榴根際土壤樣品于2015年在云南省蒙自市新安所鎮(zhèn)石榴園內(nèi)采集，分別選取石榴枯萎病根際土壤、健康石榴樹(shù)根際土壤、桃樹(shù)修復(fù)枯萎病土壤、裸地土壤(表1)，采集根系周?chē)? cm左右的根際土壤，每種土壤分別在5棵樹(shù)根際各取1份土壤，然后將其混合作為1個(gè)樣品，每種樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)，將土壤樣品置于2～8 ℃冷藏箱中保存，用于Biolog ECO微孔板法分析的土壤，收集后置于4 ℃冰箱保存，并及時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)分析。

1.2 Biolog ECO板的碳源種類(lèi)

Biolog ECO微孔板共有32個(gè)孔，第1孔為對(duì)照，加入滅菌水，其余31孔加入了不同的碳源分別是丙酮酸甲酯(A1)、吐溫40(A2)、吐溫80(A3)、環(huán)糊精(A4)、肝糖(A5)、D-纖維二糖(A6)、α-D-乳糖(A7)、β-甲基-D-葡萄糖苷(A8)、D-木糖(A9)、I-赤藻糖醇(A10)、D-甘露醇(A11)、N-乙酰-D-葡萄糖氨(A12)、D-葡糖胺酸(A13)、1-磷酸葡萄糖(A14)、D,L-α-甘油磷酸(A15)、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯(A16)、D-半乳糖醛酸(A17)、2-羥基苯甲酸(A18)、4-羥基苯甲酸(A19)、γ-羥丁酸(A20)、衣康酸(A21)、α-丁酮酸(A22)、D-蘋(píng)果酸(A23)、L-精氨酸(A24)、L-天門(mén)冬酰胺(A25)、L-苯丙氨酸(A26)、L-絲氨酸(A27)、L-蘇氨酸(A28)、甘氨酰-L-谷氨酸(A29)、 苯乙胺(A30)、腐胺(A31)。Biolog ECO微孔板的碳源均由美國(guó)ABI公司提供，已加在Biolog ECO微孔板的孔內(nèi)。

表1 土壤樣品的詳細(xì)信息

1.3 土壤微生物菌懸液的制備方法

1.3.1 土壤微生物菌懸液的制備 稱(chēng)取10 g根際土壤加入已滅菌的250 mL三角瓶中，在三角瓶中加入90 mL無(wú)菌 0.85% NaCl稀釋液，封口，于260 r/min搖床上振蕩 30 min，靜置10 min，取2 mL上清液加入18 mL已滅菌的 0.85% NaCl稀釋液中混勻，依次稀釋成10-1、10-2、10-3土壤微生物菌懸液，混勻。

1.3.2 菌懸液接種上板 將Biolog ECO微孔板從冰箱內(nèi)取出，預(yù)熱到25 ℃，用八道移液器將10-3土壤微生物菌懸液分別接種在Biolog ECO微孔板的各孔中，每孔150 μL，每個(gè)樣品32孔，每塊板3個(gè)重復(fù)；將加好樣品的Biolog ECO微孔板蓋好蓋子，置于保濕飯盒中，于25 ℃培養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中分別在4、24、48、72、96、120、144、168、192 h時(shí)進(jìn)行讀數(shù)，記錄在 590 nm 波長(zhǎng)處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Biolog ECO微孔板反應(yīng)一般采用每孔顏色平均變化率(average well color development，簡(jiǎn)稱(chēng)AWCD)來(lái)描述，其計(jì)算公式為AWCD=∑(D590 nm-DCK)/31，其中，D590 nm是除對(duì)照孔外各孔吸光度，DCK是對(duì)照孔(加入滅菌水)吸光度。使用軟件Cancoco 4.5(Micro-computer Power，Ithaca，USA)及Prcord進(jìn)行聚類(lèi)分析及主成分分析。為更直觀地得到各樣品碳代謝多樣性之間的關(guān)系，對(duì)各樣品的碳代謝多樣性數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis，簡(jiǎn)稱(chēng)PLS-DA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各類(lèi)型土壤根際微生物群落利用碳源能力的特征及規(guī)律

檢測(cè)根際微生物利用不同碳源進(jìn)行呼吸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧化還原物質(zhì)與顯色物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致的顏色變化，即可知微生物利用碳源的能力。每種土壤的AWCD最大值可表示各類(lèi)型土壤微生物群落的整體碳代謝活性，由圖1可知，桃樹(shù)修復(fù)8年的枯萎病土壤根際微生物群落碳源代謝活性最強(qiáng)(0.927)，桃樹(shù)修復(fù)6年的枯萎病土壤(0.178)與健康石榴根際土壤(0.153)的根際微生物群落碳源代謝活性接近，其中石榴園裸地土壤的微生物群落碳源代謝活性偏高(0.441)，這可能與農(nóng)戶(hù)為提高單位面積產(chǎn)出，在石榴園內(nèi)間作套種其他作物有關(guān)。

2.2 各類(lèi)型根際土壤微生物單一碳源代謝能力及聚類(lèi)分析

根據(jù)所有土壤樣品微生物碳代謝能力信息及豐度信息，用碳代謝能力信息及在每個(gè)樣品中的豐度信息繪制熱圖，并從分類(lèi)信息和樣品間差異2個(gè)層面進(jìn)行聚類(lèi)。

由圖2可知，DPS4-2土壤根際微生物對(duì)碳源2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、苯乙胺等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)D-半乳糖醛酸、γ-羥丁酸、α-丁酮酸等的利用能力較弱。DPS4-1土壤根際微生物對(duì)碳源1-磷酸葡萄糖、4-羥基苯甲酸、腐胺等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)α-D-乳糖、D-甘露醇、α-丁酮酸等的利用能力較弱。DPS4-3土壤根際微生物對(duì)碳源衣康酸、L-天門(mén)冬酰胺、苯乙胺等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)D-葡糖胺酸、γ-羥丁酸、L-苯丙氨酸等的利用能力較弱。DPS3-2土壤根際微生物對(duì)碳源吐溫80、D-葡糖胺酸、腐胺等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)α-D-乳糖、衣康酸、D-蘋(píng)果酸等的利用能力較弱。DPS3-1土壤根際微生物對(duì)碳源吐溫40、D-葡糖胺酸等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)D-蘋(píng)果酸、L-苯丙氨酸、L-蘇氨酸等的利用能力較弱。DPS3-3土壤根際微生物對(duì)碳源I-赤藻糖醇、D-葡糖胺酸、甘氨酰-L-谷氨酸等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)苯乙胺、1-磷酸葡萄糖、衣康酸等的利用能力較弱。RPS9-3土壤根際微生物對(duì)碳源丙酮酸甲酯、β- 甲基-D-葡萄糖苷、1-磷酸葡萄糖等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)D-木糖、2-羥基苯甲酸、苯乙胺等的利用能力較弱。RPS9-2土壤根際微生物對(duì)碳源環(huán)糊精、L-精氨酸、N-乙酰-D-萄萄糖氨等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)I-赤藻糖醇、2-羥基苯甲酸、苯乙胺等的利用能力較弱。RPS9-1土壤根際微生物對(duì)碳源D-纖維二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、α-丁酮酸等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)2-羥基苯甲酸、衣康酸、苯乙胺等的利用能力較弱。RPS7-3土壤根際微生物對(duì)碳源肝糖、L-苯丙氨酸、L-蘇氨酸等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)丙酮酸甲酯、D-甘露醇、甘氨酰、L-谷氨酸等的利用能力較弱。RPS7-2土壤根際微生物對(duì)碳源肝糖、D-木糖、L-苯丙氨酸等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)丙酮酸甲酯、L-天門(mén)冬酰胺、腐胺等的利用能力較弱。RPS7-1土壤根際微生物對(duì)碳源2-羥基苯甲酸、α-丁酮酸、L-蘇氨酸等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)吐溫40、吐溫80、D-甘露醇等的利用能力較弱。HPS2-3土壤根際微生物對(duì)碳源甘氨酰-L-谷氨酸的利用能力較強(qiáng)，對(duì)吐溫40、L-天門(mén)冬酰胺、γ-羥丁酸的利用能力較弱。HPS2-1土壤根際微生物對(duì)碳源α-D-乳糖、D-木糖、γ-羥丁酸等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)D-甘露醇、甘氨 酰-L-谷氨酸、L-天門(mén)冬酰胺等的利用能力較弱。HPS2-2土壤根際微生物對(duì)碳源D-甘露醇、D，L-α-甘油磷酸、4-羥基苯甲酸等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)丙酮酸甲酯、腐胺、甘氨酰-L-谷氨酸等的利用能力較弱。BLS14-3土壤根際微生物對(duì)碳源吐溫40、N-乙酰-D-葡萄糖氨、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)吐溫80、4-羥基苯甲酸、L-天門(mén)冬酰胺等的利用能力較弱。BLS14-2土壤根際微生物對(duì)碳源γ-羥丁酸、D-蘋(píng)果酸、苯乙胺等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)L-天門(mén)冬酰胺、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、腐胺等的利用能力較弱。BLS14-1土壤根際微生物對(duì)碳源丙酮酸甲酯、吐溫40、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯等的利用能力較強(qiáng)，對(duì)γ-羥丁酸、吐溫80、腐胺等的利用能力較弱。

2.3 健康石榴根際土壤與枯萎病石榴根際土壤微生物單一碳源代謝能力差異顯著性分析

對(duì)云南省蒙自市健康石榴根際土壤與枯萎病石榴根際土壤微生物代謝過(guò)程中，對(duì)碳源的利用種類(lèi)及程度進(jìn)行差異顯著性分析。由圖3可知，這2種土壤環(huán)境中微生物對(duì)13種碳源的利用程度差異顯著(P<0.05)，這13種碳源分別是丙酮酸甲酯(A1)、吐溫40(A2)、吐溫80(A3)、N-乙酰-D-葡萄糖氨(A12)、D-葡糖胺酸(A13)、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯(A16)、衣康酸(A21)、D-蘋(píng)果酸(A23)、L-精氨酸(A24)、L-天門(mén)冬酰胺(A25)、L-絲氨酸(A27)、苯乙胺(A30)、腐胺(A31)。健康石榴根際土壤與枯萎病石榴根際土壤中的微生物代謝過(guò)程對(duì)另外18種碳源的利用程度是相似的。

2.4 各類(lèi)型根際土壤微生物碳代謝多樣性的PLS-DA分析

為更直觀地得到各樣品碳代謝多樣性之間的關(guān)系，運(yùn)用PLS-DA 對(duì)各樣品的碳代謝多樣性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。由圖4可知，所有石榴枯萎病病害土壤(DPS3、DPS4)聚在一起，與石榴園裸地土壤(BLS14)的距離較近，說(shuō)明石榴園裸地土壤中的微生物碳代謝多樣性與石榴枯萎病病害土壤的微生物碳代謝多樣性較接近；栽種桃樹(shù)修復(fù)6年的石榴枯萎病土壤(RPS7)與健康石榴根際土壤(HPS2)距離較近，表明栽種桃樹(shù)修復(fù)6年的石榴枯萎病病害土壤，其微生物碳代謝多樣性與健康石榴根際土壤的微生物碳代謝多樣性較接近；栽種桃樹(shù)修復(fù)8年的石榴枯萎病土壤(RPS9)單獨(dú)聚在一起，表明經(jīng)過(guò)栽種桃樹(shù)修復(fù)8年的石榴枯萎病土壤，其微生物碳代謝多樣性與其他土壤有一定的差異。

3 結(jié)論與討論

用Biolog ECO微孔板分析方法研究了健康石榴根際土壤、枯萎病石榴根際土壤、栽種桃樹(shù)修復(fù)的枯萎病土壤及石榴園裸地土壤中微生物碳代謝的多樣性，結(jié)果表明，云南省蒙自市健康石榴根際土壤與枯萎病石榴根際土壤中的微生物對(duì)Biolog ECO微孔板中13種碳源的利用率差異顯著，分別是丙酮酸甲酯、吐溫40、吐溫80、N-乙酰-D-葡萄糖氨、D-葡糖胺酸、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、衣康酸、D-蘋(píng)果酸、L-精氨酸、L-天門(mén)冬酰胺、L-絲氨酸、苯乙胺、腐胺。根際微生物群落碳源代謝能力以栽種桃樹(shù)修復(fù)8年枯萎病土壤最大，栽種桃樹(shù)可以提高石榴枯萎病病害土壤的微生物群落碳源代謝能力，對(duì)石榴枯萎病病害土壤有一定的修復(fù)作用。

使用Biolog ECO微孔板法分析根際微生物多樣性的報(bào)道較多[7-8]。余賢美等用Biolog ECO微孔板法剖析土壤功能多樣性受枯草芽孢桿菌Bs-15的影響[9]。張志紅等采用Biolog ECO微孔板方法探究了生物復(fù)混肥、堆肥、生物有機(jī)肥的促生、枯萎病防病效果及對(duì)土壤微生物功能多樣性的影響[10]。孫鳳霞等用Biolog ECO微孔板技術(shù)探究紅壤長(zhǎng)期定位施肥19年的微生物碳源利用率，結(jié)果表明，微生物碳源利用率在化肥配合應(yīng)用或只施有機(jī)肥19年后均顯著提高[11]。張杰等用Biolog ECO微孔板技術(shù)對(duì)鄱陽(yáng)湖圍墾水稻田、自然濕地、退田還湖退耕地的表層土壤微生物單一碳源運(yùn)用能力狀況進(jìn)行了探究[12]。張麗娟等用Biolog ECO微孔板技術(shù)探究健康大蒜與根腐型病害大蒜根際土壤微生物功能多樣性的差異[13]。董艷等研究了3個(gè)小麥品種與蠶豆間作對(duì)根際微生物代謝功能多樣性、枯萎病發(fā)生和枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響，結(jié)果表明，蠶豆與小麥間作提升了蠶豆根際微生物的碳源利用能力[14]。柳紅娟等利用木薯莖葉還田改善土壤微生物種群，可以降低香蕉枯萎病的發(fā)病率[15]。在本研究中，基于在枯萎病病害石榴果園中再植石榴樹(shù)難以成活，用栽種桃樹(shù)的方法對(duì)石榴枯萎病病害土壤進(jìn)行修復(fù)，結(jié)果表明，栽種桃樹(shù)修復(fù)6年的石榴枯萎病土壤，其微生物碳代謝多樣性與健康石榴根際土壤的微生物碳代謝多樣性接近，栽種桃樹(shù)修復(fù)8年的石榴枯萎病土壤根際微生物群落碳源代謝多樣性最高，研究表明栽種桃樹(shù)可以逐步改善石榴枯萎病害土壤的微生物多樣性，對(duì)石榴枯萎病害土壤有一定的修復(fù)效果。