吳保為，吳家琪，胡玉潔，賈志強(qiáng)，高 雪，劉雅婷

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201)

朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒(hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV)屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)，是2013年在中國(guó)云南省發(fā)現(xiàn)的番茄斑萎病毒屬新種[1-2]。該病毒主要通過薊馬進(jìn)行傳播，能夠系統(tǒng)侵染朱頂紅、煙草、番茄、辣椒、蜘蛛蘭等多種經(jīng)濟(jì)作物，引起植物出現(xiàn)壞死、褪綠、同心環(huán)紋等癥狀，危害嚴(yán)重[3]。HCRV為三分基因組，3段單鏈RNA序列從小到大分別為S RNA、M RNA、L RNA，其中S RNA序列含有2個(gè)開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，其正向編碼444 aa的非結(jié)構(gòu)蛋白(NSs)，相關(guān)研究表明，tospoviruses編碼的NSs蛋白可能在病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、抑制RNA沉默中起重要作用[4]。S RNA反向編碼275 aa的核殼體蛋白(N)，核殼體蛋白是研究Tospovirus病毒時(shí)，普遍最先獲得的病毒序列，其序列特異性極高[5]，因此，通常都是利用比對(duì)核殼體蛋白N基因的相似性來檢測(cè)與鑒定Tospovirus的病毒[6]。

目前，針對(duì)HCRV的研究較少，NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)公布的HCRV S RNA全基因組序列僅有2個(gè)，而且其常見寄主主要集中在蜘蛛蘭、番茄等植物上，本研究通過大量野外采樣調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了新的HCRV寄主——君子蘭，通過對(duì)該病毒君子蘭分離物的S RNA進(jìn)行克隆，測(cè)序及序列分析，獲得了1個(gè)完整的HCRV S RNA基因組序列，為進(jìn)一步開展HCRV研究提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

病毒樣本于2016年7月11日采自云南省昆明市云南農(nóng)業(yè)大學(xué)的君子蘭葉片，保存至-80 ℃超低溫冷凍冰箱中。

1.2 試劑

TransZol Plant試劑盒、pEASY-T1載體、T1感受態(tài)細(xì)胞、Fast Pfu酶、Buffer及dNTP、Taq酶、SuperMix酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收純化試劑盒，購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；dATP、Marker購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；TSWV、INSV、IYSV、WSMoV&GBNV、GRSV&TCSV抗體，購(gòu)自美國(guó)Agdia公司；HCRV、TZSV、CCSV、CaCV抗體，由筆者所在課題組制備；PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自TaKaRa公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 方法

1.3.1 樣本鑒定

1.3.1.1 ELISA檢測(cè) 利用筆者所在課題組構(gòu)建的ELISA血清學(xué)鑒定體系，使用了9種抗體對(duì)君子蘭樣本進(jìn)行了鑒定。其中5種抗體(TSWV、INSV、IYSV、WSMoV&GBNV、GRSV&TCSV)使用的是雙抗夾心法(DAS-ELISA)，另外4種抗體(HCRV、TZSV、CCSV、CaCV)使用的是間接法(ID-ELISA)。參照對(duì)應(yīng)方法說明書操作。

1.3.1.2 RT-PCR檢測(cè) RNA提取：應(yīng)用北京全式金公司的RNA提取試劑盒對(duì)君子蘭樣本進(jìn)行RNA提取。RT-PCR：RT使用的TaKaRa公司的RT試劑盒，PCR使用的是北京全式金公司的SuperMix酶。利用6對(duì)特異性引物及1對(duì)通用引物J13/UHP(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.2 RNA提取、RT-PCR 利用TransZol Plant多糖多酚RNA提取試劑盒提取君子蘭樣本的總RNA。

利用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit合成樣本cDNA的第一條鏈。

表1 RT-PCR檢測(cè)所用引物信息

病毒分離物的S RNA全序列的擴(kuò)增引物HCRV-S(F：5′-AGAGCAATCGAGGTATAAACAAATAATCATACAC-3′；R：5′-AGAGCAATCGAGGTATAAAACATAAATTCTGAAC-3′)由筆者所在課題組利用Primer 5.05設(shè)計(jì)，并用oligo 7對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行分析，引物序列送至鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。利用FastPfu高保真酶，以合成的cDNA第一條鏈為模板，利用引物HCRV-S進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL PCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，F(xiàn)astPfu 1 μL，buffer 10 μL，dNTP 4 μL，ddH2O 32 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR反應(yīng)完成后，取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.3 產(chǎn)物膠回收純化及加A反應(yīng) 利用DNA膠回收試劑盒對(duì)上一步獲得的目的條帶進(jìn)行切膠回收，從而得到純化過的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物-20 ℃保存。利用dATP、buffer、Taq酶對(duì)純化后的S RNA序列PCR產(chǎn)物進(jìn)行加A反應(yīng)。10 μL加A體系：PCR產(chǎn)物7 μL，Taq酶 1 μL，buffer 1 μL，dATP 1 μL。加A反應(yīng)程序：72 ℃ 30 min。

1.3.4 病毒分離物S序列的克隆和轉(zhuǎn)化 將純化并加A后的PCR產(chǎn)物連接到pEASY-T1載體上，導(dǎo)入到T1感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選挑取白色單菌落，通過菌液PCR篩選出陽性重組子，將3個(gè)陽性重組子的菌液送至鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.5 病毒分離物序列處理 利用MEGA軟件對(duì)測(cè)序公司返回的序列進(jìn)行人工處理，去掉序列2端的載體序列，去掉序列3′端的A，從而獲得病毒分離物的S RNA全基因組序列。

1.3.6 病毒分離物S序列分析 利用Mega 6.06，DNAstar. Lasergene v7.1等序列分析軟件，從序列特征、系統(tǒng)進(jìn)化分析等方面，對(duì)獲得的病毒分離物HCRV-CM S RNA全基因組序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HCRV-CM病毒分離物S序列RT-PCR擴(kuò)增

以采集到的云南君子蘭葉片為材料提取總RNA，RT獲得cDNA，以其為模板，用設(shè)計(jì)的HCRV S全序列擴(kuò)增引物擴(kuò)增出大小約為2 749 bp的特異性條帶(圖1)。

2.2 HCRV-CM分離物S序列克隆轉(zhuǎn)化

共挑取20個(gè)單菌落，利用T1載體通用引物M13 F/R，通過菌液PCR篩選陽性重組子。電泳結(jié)果顯示，挑取的20個(gè)單菌落均為陽性重組子(圖2)。

2.3 HCRV-CM分離物S RNA序列分析

2.3.1 序列特征 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載首個(gè)公布的HCRV S RNA全序列HLS1-2 S RNA(GenBank登錄號(hào)：JX833564.1)，利用DNAstar進(jìn)行序列比對(duì)，本研究分離的HCRV-CM的S序列(GenBank登錄號(hào)：KY484836)與其一致性為98.7%(表2)。

2.3.2 HCRV-CM系統(tǒng)進(jìn)化分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載所有已公布的HCRV病毒的核殼體蛋白N基因序列，與本研究所獲得的N基因序列保存在一起，通過Mega 6.06，利用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建基于S RNA序列編碼的Np基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。從系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，本研究獲得的病毒分離物HCRV-CM的Np基因與分離自云南省的HCRV的Np基因序列聚為一支(圖3)。

3 討論

Tospovirus病毒擴(kuò)增迅速，近年來，該屬新增的病毒不斷增多，寄主范圍也不斷加大，根據(jù)ICTV公布的信息，Tospovirus已經(jīng)有11個(gè)確定種。云南省氣候類型多樣，植被資源豐富，為病毒提供了廣泛的寄主條件。目前，云南已經(jīng)報(bào)道了6種Tospovirus病毒，分別是番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus，TSWV)[7]、鳳仙花壞死斑病毒(impatiens necrotic spot virus，INSV)[8]、花生環(huán)斑病毒(groundnut ringspot virus，GRSV)[9]、 番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒(tomato zonate spot virus，TZSV)[10]、馬蹄蓮?fù)示G斑病毒(calla lily chlorotic spot virus，CCSV)[11]、朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒(hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV)。HCRV是2013年在云南省發(fā)現(xiàn)的Tospovirus新種，其寄主范圍僅集中在幾種常見的tospoviruses寄主中，仍有眾多的植物寄主未被發(fā)現(xiàn)。本研究利用RT-PCR以及ELISA技術(shù)在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)的君子蘭上檢測(cè)到該病毒，并克隆了該病毒分離物的S RNA全基因組序列，對(duì)其序列特征以及分類地位進(jìn)行了分析，為后續(xù)進(jìn)一步研究HCRV提供了基礎(chǔ)。此外，研究HCRV寄主范圍具有極其重要的意義，通過了解其寄主的擴(kuò)張以及范圍的增大，可以及時(shí)探究該病毒的危害。

表2 HCRV-CM與HLS1-2分離物核苷酸和氨基酸序列一致性比對(duì)

本研究獲得的HCRV-CM分離物表明君子蘭(Cliviaminiata)是Tospovirus新的寄主，HCRV-CM S RNA(GenBank登錄號(hào)：KY484836)在序列結(jié)構(gòu)上與全球首次公布的HCRV HLS1-2分離物的S RNA基本一致，其編碼的2個(gè)蛋白NSs、Np，以及非編碼區(qū)、IGR區(qū)，與HLS1-2 S RNA的一致性都在90%以上，僅3′UTR區(qū)域在堿基數(shù)目上相差較大，HCRV-CM的S RNA的3′UTR相比HCRV HLS1-2多了19個(gè)堿基。在對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的Np序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)本研究分離的HCRV-CM株系與來自云南省的HCRV分離物聚為一支，來自廣東、廣西和福建的HCRV株系聚為另一支，株系明顯存在按照地理進(jìn)行分布的跡象。