張玉波，周中艷，王廷慧，鄧 娟

(1.安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院，貴州安順 561000； 2.貴州省昆蟲(chóng)信息系統(tǒng)與資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州安順 561000)

COⅠ基因包含豐富的遺傳信息，既相對(duì)保守又能保證足夠變異，可作為屬種系統(tǒng)進(jìn)化研究的良好標(biāo)記，被認(rèn)為是動(dòng)物界中最適合的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因[1-2]，目前已被廣泛應(yīng)用于昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)發(fā)育分析。密碼子偏好性指在編碼氨基酸合成蛋白時(shí)，往往優(yōu)先使用某一種或幾種密碼子[3]，被優(yōu)先選用的密碼子稱(chēng)為最優(yōu)密碼子，這一現(xiàn)象廣泛存在于絕大部分的生物類(lèi)群中[4]。Lynn等研究認(rèn)為，不同的物種對(duì)密碼子的使用具有很強(qiáng)的特異性，在進(jìn)化過(guò)程中相近的物種具有相似的密碼子使用模式，說(shuō)明物種的密碼子使用特點(diǎn)在進(jìn)化過(guò)程中具有保守性，這種變化直接反映在核苷酸的組成上[5]。宋喬喬等對(duì)17種動(dòng)物進(jìn)行研究得出，密碼子偏好性與物種之間的親緣關(guān)系有關(guān)，親緣關(guān)系越近的差異越小[6]。張曉峰等對(duì)水稻和擬南芥NBS-LRR基因家族同義密碼子使用偏好的研究得出，NBS-LRR基因家族的密碼子使用偏好受物種自身的影響很大[7]。晁岳恩等對(duì)11種植物psbA基因進(jìn)行密碼子偏好性分析，認(rèn)為密碼子偏好性不能正確反映物種間的進(jìn)化關(guān)系[8]。

頭喙亞目(Auchenorrhyncha)屬于昆蟲(chóng)綱(Insect)半翅目(Hemiptera)，活潑善跳，飛翔能力強(qiáng)，刺吸式口器，在吸取植物汁液后傳染病毒，是重要的農(nóng)林害蟲(chóng)。目前，該亞目的4個(gè)總科分類(lèi)系統(tǒng)被昆蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)者廣泛接受，即蠟蟬總科(Fulgoroidea)、蟬總科(Cicadoidea)、沫蟬總科(Cercopoidea)、葉蟬總科(Cicadelloidea)[包括角蟬科(Membracidae)及其近緣科]。近年來(lái)研究表明，蠟蟬總科、沫蟬總科、角蟬總科(包括傳統(tǒng)的葉蟬總科)、蟬總科均為單系群[9]。Campbell等多位學(xué)者就頭喙亞目是否為一單系群進(jìn)行了研究，總體上認(rèn)為蠟蟬次目與異翅亞目的親緣關(guān)系較近或?yàn)榻忝萌篬10-12]，線(xiàn)粒體基因組數(shù)據(jù)的研究同樣支持頭喙亞目為并系，但也認(rèn)為鞘喙亞目與蠟蟬次目為姐妹群關(guān)系[13-15]。

本研究基于半翅目(Hemiptera)30種昆蟲(chóng)線(xiàn)粒體COⅠ基因密碼子偏好性，利用SPSS 19.0對(duì)其密碼子偏好性進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，探究頭喙亞目中各類(lèi)群之間的關(guān)系及密碼子偏好性在該類(lèi)群的系統(tǒng)發(fā)育分析中的可信度。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)

從GenBank中選擇線(xiàn)粒體全基因組測(cè)序完整的30種昆蟲(chóng)，其中頭喙亞目下蠟蟬總科有9種昆蟲(chóng)、沫蟬總科有5種昆蟲(chóng)、葉蟬總科有10種昆蟲(chóng)、蟬總科有3種昆蟲(chóng)，鞘喙亞目(Coleorrhyncha)鞘喙蝽總科(Karabasiidae)有3種昆蟲(chóng)。獲得其中COⅠ基因全長(zhǎng)編碼區(qū)序列(coding sequence，簡(jiǎn)稱(chēng)CDS)部分，全基因組登錄號(hào)見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1COⅠ基因中G、C含量分析 采用CodonW 1.4.2對(duì)30種昆蟲(chóng)COⅠ基因序列密碼子進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)分析基因密碼子的堿基組成規(guī)律，測(cè)得鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶總體(G+C)含量、密碼子第3位堿基(A3、G3、C3、T3)組成、密碼子第3位的 C+G 數(shù)量(GC3)等數(shù)據(jù)。

1.2.2 有效密碼子數(shù)量(effective number of codons，簡(jiǎn)稱(chēng)ENC)及同義密碼子使用度(relatively synonymous codon usage，簡(jiǎn)稱(chēng)RSCU)分析 參照Fuglsang的方法[16]，利用有效密碼子數(shù)來(lái)衡量基因單個(gè)密碼子使用頻率的偏好程度，其值在 20～61之間，越接近20偏好性越強(qiáng)[17]。同義密碼子相對(duì)使用度是指對(duì)于某一特定的密碼子在編碼對(duì)應(yīng)氨基酸的同義密碼子間的相對(duì)概率。采用同義密碼子相對(duì)使用度作為衡量COⅠ基因密碼子使用偏好性的指標(biāo)，RSCU越高，表示該密碼子的相對(duì)使用率越高，它去除了氨基酸組成對(duì)密碼子使用的影響參考，直觀(guān)地反映了密碼子使用的偏好性[18]。

表1 線(xiàn)粒體全基因組序列登錄號(hào)

1.2.3 RSCU聚類(lèi)分析 參照劉漢梅等利用SPSS 19.0對(duì)30種半翅目昆蟲(chóng)線(xiàn)粒體COⅠ基因RSCU進(jìn)行聚類(lèi)分析[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 COⅠ基因的密碼子偏好性

各種類(lèi)COⅠ基因的有效密碼子數(shù)及密碼子第3位的堿基含量見(jiàn)表2。分析COⅠ基因的堿基組成發(fā)現(xiàn)，30種昆蟲(chóng)中G+C含量在28.1%～36.4%之間，A、T含量明顯高于G、C。密碼子也以A或T結(jié)尾較多，A、T含量分別在34.65%～72.68%、28.27%～57.23%之間。30種昆蟲(chóng)密碼子第3位4種堿基T、C、A、G占比平均值分別為40.66%、13.96%、58.04%、5.97%。這與Clary等指出的昆蟲(chóng)線(xiàn)粒體基因組具有比較高的A、T堿基含量，密碼子的第3位傾向于選擇A或T的結(jié)果[21-22]相符。

30種昆蟲(chóng)COⅠ基因的ENC在30.95～48.53之間，平均值為37.25，總體上看本研究所選用的類(lèi)群基因密碼子具有較強(qiáng)的偏好性。沫蟬總科、蟬總科、葉蟬總、蠟蟬總科、鞘喙蝽總科等代表物種的ENC平均值分別為31.88、34.22、35.92、39.98、45.44。其中，相對(duì)古老的類(lèi)群如蠟蟬總科、鞘喙蝽總科的ENC明顯較高，說(shuō)明其COⅠ基因密碼子偏好性較弱，較為進(jìn)化的類(lèi)群如沫蟬總科(Cercopoidea)、蟬總科(Cicadoidea)的COⅠ基因密碼子偏好性較強(qiáng)。梁愛(ài)萍通過(guò)對(duì)多位學(xué)者的研究總結(jié)提出，半翅目中親緣關(guān)系為胸喙亞目+{蟬子亞目+[蠟蟬子亞目+(鞘喙亞目+異翅亞目)]}[9]；Wang等通過(guò)對(duì)頭喙亞目線(xiàn)粒體全基因組的分析得出，頭喙亞目?jī)?nèi)的親緣關(guān)系為蠟蟬總科+[葉蟬總科+(沫蟬總科+蟬總科)][23-24]。通過(guò)前后對(duì)比發(fā)現(xiàn)，同一單系群中親緣關(guān)系越近的類(lèi)群其COⅠ基因有效密碼子數(shù)量差別越小，且在進(jìn)化中越古老的類(lèi)群COⅠ基因密碼子偏好性越弱，這可能與線(xiàn)粒體COⅠ基因具有較高的進(jìn)化速率有一定的關(guān)系。

2.2 COⅠ基因CDS聚類(lèi)分析

以每一條基因代表作為對(duì)象，將該基因的RSCU作為變量，根據(jù)基因中各密碼子RSCU，利用SPSS 19.0進(jìn)行聚類(lèi)分析。

由圖1可知，褐飛虱屬(Nilaparvata)中3個(gè)物種及禾沫蟬屬(Callitettix)中3個(gè)物種分別完美地聚在了一起，沫蟬總科5個(gè)、葉蟬總科10個(gè)、蟬總科3個(gè)物種均較好地聚在一起，說(shuō)明基于COⅠ基因密碼子偏好性的聚類(lèi)分析可以在一定程度上反映物種之間的親緣關(guān)系。蠟蟬總科中的斑衣蠟蟬(Lycormadelicatula)與八點(diǎn)廣翅蠟蟬(Ricaniaspeculum)聚在了沫蟬總科里，蠟蟬總科內(nèi)種類(lèi)也聚成了2支，且聚類(lèi)混亂。這些不正確的聚類(lèi)估計(jì)與蠟蟬總科的COⅠ基因密碼子偏好性較弱有一定的關(guān)系。鞘喙蝽總科2種昆蟲(chóng)同絕大部分的蠟蟬總科聚在了一起，這與Song等通過(guò)線(xiàn)粒體基因組數(shù)據(jù)對(duì)比支持鞘喙亞目與蠟蟬次目親緣關(guān)系較近的結(jié)果[13-15]較為一致。

表2 COⅠ基因密碼子偏好性及密碼子第3位堿基的構(gòu)成

注：3s表示密碼子第3位堿基的構(gòu)成。

3 討論

通過(guò)以上研究發(fā)現(xiàn)，基于30種昆蟲(chóng)COⅠ基因密碼子偏好性的聚類(lèi)分析在一定程度上可以反映物種間的親緣關(guān)系，但也有一定的局限性，如蠟蟬總科下的昆蟲(chóng)類(lèi)群聚類(lèi)結(jié)果較為混亂，可能在同一單系群中COⅠ基因密碼子偏好性的聚類(lèi)分析更適用于較為進(jìn)化的類(lèi)群。雖然本研究結(jié)果表明，同一單系群中越古老的類(lèi)群其COⅠ基因密碼子偏好性相對(duì)越弱，但考慮COⅠ基因的長(zhǎng)度較小，選用的物種數(shù)量有限等問(wèn)題，這一結(jié)果尚須要更多的數(shù)據(jù)來(lái)證實(shí)。研究中選用的2屬6種昆蟲(chóng)極好地聚成了2個(gè)分支，而較高級(jí)分類(lèi)階元之間聚類(lèi)稍顯混亂，也顯示出基于COⅠ基因的昆蟲(chóng)密碼子偏好性聚類(lèi)分析更適于低級(jí)階元親緣關(guān)系的研究，這可能與COⅠ基因的長(zhǎng)度小、進(jìn)化較快有一定的關(guān)系。