曾 輝 唐成芳 周 芳 左艷萍 張耀超

骨質(zhì)疏松是中老年人的常見病和多發(fā)病，骨質(zhì)疏松癥的主要特征包括骨礦密度降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞，以致骨的脆性增加，骨折危險性增高[1]。臨床及動物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),系統(tǒng)性骨質(zhì)疏松患者同時伴有牙槽骨骨質(zhì)疏松樣改變[2-3]。牙槽骨是上下頜骨包圍和支持牙根的骨組織，牙槽骨骨質(zhì)疏松可加重牙周炎骨吸收[4]、延長種植體骨融合時間[5]，使牙齒及種植體松動、脫落、缺失率增加，妨礙老年人咀嚼、發(fā)音功能及面部協(xié)調(diào)美觀，嚴(yán)重影響老年人的身心健康和生活質(zhì)量。因此，尋找防治骨質(zhì)疏松的藥物，以維護(hù)老年人口腔及全身健康已成為一項重要任務(wù)。

骨碎補(bǔ)總黃酮是從中藥骨碎補(bǔ)中提取的有效成分。研究表明，骨碎補(bǔ)總黃酮可增加骨質(zhì)疏松大鼠椎骨的骨量，改善骨三維結(jié)構(gòu)[6]，并已初步運(yùn)用于臨床骨質(zhì)疏松癥的輔助治療[7]，但它對牙槽骨結(jié)構(gòu)的影響及相關(guān)機(jī)制的研究尚未展開。本研究擬將骨碎補(bǔ)總黃酮以全身用藥的方式給予去卵巢雌性大鼠，觀察該藥對去卵巢大鼠牙槽骨結(jié)構(gòu)的影響，同時觀察大鼠血鈣、血磷、堿性磷酸酶水平以提供骨代謝信息，為骨碎補(bǔ)總黃酮防治牙槽骨骨質(zhì)疏松的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 24只3月齡雌性未孕SD大鼠(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，體重230±30g。自由飲水，分籠飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：對照組、模型組、骨碎補(bǔ)總黃酮組，每組8只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 骨碎補(bǔ)總黃酮(中國中醫(yī)研究院西苑醫(yī)院和四川中藥研究所研制，批號961214)，使用時加滅菌水制成一定濃度溶液(0.46g·L-1)。水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠牙槽骨骨質(zhì)疏松模型造模與給藥對照組僅切除雙側(cè)卵巢附近脂肪組織，其余兩組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，術(shù)后1周對建模大鼠進(jìn)行陰道涂片，連續(xù)5d，觀察去卵巢大鼠不出現(xiàn)動情周期，表明去除卵巢成功。從去卵巢手術(shù)當(dāng)天開始計時，術(shù)后3個月骨碎補(bǔ)總黃酮組給予骨碎補(bǔ)總黃酮216mg/(kg·d-1)灌胃治療，對照組和模型組給予等計量的生理鹽水，連續(xù)服藥12周。

1.2.2 血鈣(Ca)、血磷(P)、堿性磷酸酶(ALP)濃度檢測 各組大鼠連續(xù)灌胃12周，腹腔注射麻醉后腹主動脈取血，3500r·min-1離心15min，取血清，采用日立7170型全自動生化分析儀檢測大鼠血清Ca、P、ALP濃度，血Ca、血P、ALP試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所，HY2468)。

1.2.3 牙槽骨病理形態(tài)觀察 連續(xù)灌胃給藥12周處死動物，取其左側(cè)下頜牙槽骨磨牙段，立即放入10%甲醛內(nèi)固定48h后取出，10%EDTA脫鈣3周，常規(guī)石蠟包埋，沿下頜正中矢狀斷面切成5μm厚的連續(xù)切片，牙合染色，光鏡觀察。

1.2.4 牙槽骨骨組織形態(tài)計量學(xué)測量 上述各組大鼠下頜牙槽骨磨牙段常規(guī)制片，利用MOTIC微機(jī)圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行骨組織形態(tài)學(xué)測量。在光鏡下采集下頜第二磨牙兩個牙根之間松質(zhì)骨圖像，依照等距隨機(jī)抽樣原則，同一標(biāo)本選3張切片，每張切片選3個觀察視野。用Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對上面所得圖像進(jìn)行骨組織形態(tài)計量學(xué)相關(guān)參數(shù)測定，包括以下指標(biāo)：總組織面積(T.Ar)、骨小梁周長(Tb.Pm)和骨小梁面積(Tb.Ar)。利用相關(guān)公式計算：骨小梁面積百分率%Tb.Ar=Tb.Ar/T.Ar×100%；骨小梁厚度Tb.Th=(2/1.99)×(Tb.Ar/Tb.Pm)；骨小梁間距 Tb.Sp=(T.Ar-Tb.Ar)/Tb.Pm[8]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。測量值以x±s表示，樣本間的比較采用單因素組間方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 牙槽骨組織病理形態(tài)觀察 光鏡下觀察大鼠下頜第二磨牙矢狀切面圖(圖1)可見：對照組大鼠下頜第二磨牙兩牙根間的牙槽骨由骨小梁和骨髓腔組成，骨小梁致密，整齊排列，相互連接，骨髓腔間隙小，未見異常骨吸收；模型組大鼠牙槽骨吸收嚴(yán)重，骨小梁稀疏、斷裂、排列紊亂，局部呈蠶食樣改變，骨髓腔增大，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松樣改變；經(jīng)骨碎補(bǔ)總黃酮治療后，可見牙槽骨骨小梁變粗呈片狀，骨髓腔縮小，骨小梁間隙減小，骨量增多。

圖1 各組大鼠牙槽骨病理組織學(xué)改變(HE 100×)

2.2 牙槽骨形態(tài)計量學(xué)參數(shù)測量 由表1可知，與對照組相比，模型組%Tb.Ar減少36.72%(P＜0.05)，Tb.Th 顯著減小(P＜0.05)，Tb.Sp 顯著增加(P＜0.05)。與模型組相比，骨碎補(bǔ)總黃酮組%Tb.Ar升高39.91%(P＜0.05)，Tb.Th顯著增高(P＜ 0.05)，Tb.Sp 顯著減小(P＜ 0.05)，其中%Tb.Ar已與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

表1 各組大鼠牙槽骨骨小梁參數(shù)(s,n=8)

表1 各組大鼠牙槽骨骨小梁參數(shù)(s,n=8)

注：*與對照組比較P＜0.05；#與模型組比較P＜0.05。

組別 骨小梁面積百分率%Tb.Ar骨小梁厚度Tb.Th(μm)骨小梁間距Tb.Sp(μm)對照組模型組骨碎補(bǔ)總黃酮組51.63±11.96#32.67±3.06*45.71±9.25#156.98±42.14#107.54±25.08*139.08±50.13*#128.78±33.21#256.39±50.68*166.37±33.61*#

2.3 各組大鼠血Ca、P、ALP濃度變化 如表2所示，與對照組比較，模型組大鼠血Ca顯著降低(P＜0.05)，ALP顯著升高(P＜0.05)。骨碎補(bǔ)總黃酮治療后，可顯著升高大鼠血Ca(P＜0.05)，降低ALP水平(P＜0.05)，但對大鼠血P無明顯作用。

表2 各組大鼠血鈣、血磷、堿性磷酸酶濃度(x±s,n=8)

3.討論

近年來，不少學(xué)者對全身性骨質(zhì)疏松與牙槽骨骨質(zhì)疏松間的關(guān)系做了若干研究，大多研究結(jié)果證實(shí)牙槽骨骨量丟失、出現(xiàn)骨質(zhì)疏松樣改變是全身骨質(zhì)變化的局部表現(xiàn)[9]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠牙槽骨骨小梁稀疏，出現(xiàn)大的骨髓腔，呈典型骨質(zhì)疏松樣改變。骨碎補(bǔ)總黃酮是骨碎補(bǔ)中所含黃酮類化合物的總和，具有補(bǔ)腎壯骨、續(xù)傷止痛的功效。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，骨碎補(bǔ)總黃酮能促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞增殖[10]，而牙周膜中成功分離的干細(xì)胞正是牙槽骨再生的主要細(xì)胞來源；動物實(shí)驗(yàn)研究顯示，骨碎補(bǔ)總黃酮能改善骨質(zhì)疏松大鼠股骨微結(jié)構(gòu)，增加骨密度和機(jī)械強(qiáng)度[11]；臨床研究證實(shí)骨碎補(bǔ)總黃酮能有效治療絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥,可有效緩解骨質(zhì)疏松性骨痛癥[12]。由于口腔骨丟失是全身骨質(zhì)變化的局部表現(xiàn)，因此，應(yīng)用骨碎補(bǔ)總黃酮對牙槽骨骨質(zhì)疏松進(jìn)行防治研究具有合理性。

本研究顯示，骨碎補(bǔ)總黃酮連續(xù)治療12周后，牙槽骨組織形態(tài)較模型組顯著改善，骨髓腔減小、骨小梁變粗。骨組織形態(tài)計量學(xué)結(jié)果顯示：經(jīng)骨碎補(bǔ)總黃酮治療后牙槽骨骨小梁厚度、骨小梁面積百分率較模型組顯著增加(P＜0.05)，骨小梁間距顯著減小(P＜0.05)，其中骨小梁面積百分率與對照組相比已無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。以上結(jié)果說明，骨碎補(bǔ)總黃酮對卵巢切除所致的牙槽骨結(jié)構(gòu)的破壞有明顯改善作用,對牙槽骨骨質(zhì)疏松癥有明顯的防治作用。

血清鈣磷濃度變化在骨礦代謝中占有重要位置，其中血清中鈣含量的檢測對鈣磷代謝的研究具有重要意義[13]。本研究中，骨碎補(bǔ)總黃酮可顯著增加去卵巢大鼠血鈣濃度(P＜0.05)，提示其可抑制血清中鈣含量的丟失，從而影響骨礦代謝。各組之間血磷濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，這與楊鋒等[14]研究結(jié)果一致，而血磷水平穩(wěn)定正是骨生長和礦化的必要條件之一[15]。血ALP是反應(yīng)骨代謝最重要的酶，是最常見的評價骨形成和骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo)[16]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠血清ALP升高可能是骨質(zhì)流失、骨吸收亢進(jìn)伴成骨細(xì)胞功能活躍的結(jié)果，反映了骨改建的活躍狀態(tài)，骨碎補(bǔ)總黃酮連續(xù)治療12周后可顯著降低大鼠血ALP水平，說明骨碎補(bǔ)總黃酮能糾正去卵巢所致大鼠血ALP水平升高的高骨轉(zhuǎn)換率現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中骨碎補(bǔ)總黃酮治療組仍有一些檢測指標(biāo)未恢復(fù)至正常水平，可在后期進(jìn)一步研究其最佳給藥劑量及治療時間。

綜上所述，去卵巢可誘導(dǎo)大鼠牙槽骨骨量丟失，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松樣改變，血清骨代謝指標(biāo)表現(xiàn)為骨高轉(zhuǎn)換。骨碎補(bǔ)總黃酮可以明顯改善牙槽骨結(jié)構(gòu)、增加牙槽骨骨量，血清骨代謝指標(biāo)提示其可能通過降低骨高轉(zhuǎn)換，抑制牙槽骨吸收，促進(jìn)牙槽骨形成。但其具體影響機(jī)制、最佳劑量及給藥時間等還需要進(jìn)一步研究和探討。