牛家強,王玉恒,索朗斯珠,強巴央宗,徐業(yè)芬*，郭 敏,程玲華,楊士承

(1.西藏農牧學院動物科學學院，林芝 860000； 2.西藏農牧學院西藏高原動物疫病研究自治區(qū)高校重點實驗室，林芝 860000； 3.中國農業(yè)大學動物科技學院，北京 100193)

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類內源性非蛋白質編碼的RNA分子，約含有18～24個核苷酸，其一般通過作用于靶基因的3′UTR引起靶基因降解或者翻譯受阻，從而調控基因表達[1-2]。1993年Lee等[3]在秀麗隱桿線蟲中首次發(fā)現(xiàn)微小RNA-Lin-4，它能通過與其3′UTR結合，調控線蟲細胞的發(fā)育。從此越來越多的學者展開對miRNA的相關研究。迄今為止，已通過克隆和測序技術分析出人[4]、小鼠[5-6]、豬[7]、牛[8]、羊[9]等多個物種的卵巢組織miRNA的表達譜，而且對顆粒細胞[10]、卵母細胞[11]、卵泡液[12]和黃體[13]等特定卵巢組織的miRNA的研究也有重大發(fā)現(xiàn)。Otsuka等[14-16]在小鼠卵巢中敲除miRNA生成過程的關鍵酶Dicerl(dicerl hypomorphic)后，導致雌鼠不育；Medeiros等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-290-295缺陷會引起原始生殖細胞的丟失，從而導致雌性小鼠不育；Yin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-383通過靶定RNA結合基序單鏈結合蛋白1(RNA binding motif,single stranded interacting protein 1,RBMS 1)基因能促進小鼠顆粒細胞增殖和激素分泌；Pangas等[19-20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-224通過調控Smad4基因表達，從而促進小鼠顆粒細胞增殖和芳香酶表達；Yan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-145通過靶定細胞周期素D2(cyclinB 1,Ccnd 2)基因抑制小鼠顆粒細胞的增殖；Lin等[22]在豬卵巢卵泡中發(fā)現(xiàn)，miR-26b通過靶向DNA損傷相關基因的銨轉運蛋白(ammonium transporter,AMT)基因，從而調控顆粒細胞凋亡；Ma和Xu 等[13, 23]在豬和牛顆粒細胞中均發(fā)現(xiàn)miR-378直接靶向芳香酶，從而調控雌二醇的分泌，這些研究進一步表明，miRNA在動物卵巢卵泡中發(fā)揮著不可替代的作用[24-26]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，bta-miR-146a在牦牛心、肝、脾、肺、腎、淋巴結、卵巢等組織中均有表達，其中在卵巢組織中的表達量較高[27]。然而關于bta-miR-146a靶基因的研究鮮見報道。

因此，本試驗通過生物信息學軟件分析bta-miR-146a的靶基因并從中選取卵巢卵泡發(fā)育相關的靶基因進行靶基因驗證，為bta-miR-146a在牦牛卵巢卵泡發(fā)育中可能發(fā)揮的功能機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要的試劑與儀器

293T細胞株(廣州吉妮歐生物科技有限公司)；限制性內切酶(Thermo Fisher)；無內毒素質粒提取試劑盒(D6915，Omega)；連接酶(EL0011，Thermo Fisher)；PCR 產物回收試劑盒(D6492，Omega)；KOD酶(KOD-FX，Toyobo)；DMEM(11965-092，Gibico)；Fetal Bovine Serum(10099-141，Gibico)；Trypsin-EDTA (25300-062，Gibico)；Lipofectamine 2000 Reagent(11668-019，Thermo Fisher)；Dual-Luciferase Reporter Assay System(E1910，Promega)。

熒光倒置顯微鏡(1X71，OLYMPUS)；離心機(3K15，Sigma)；電泳槽(JK-SPFT，北京君意東方電泳設備有限公司)；電泳儀(JY300C，北京君意東方電泳設備有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(NCO15AC，Sanyo)；凝膠成像系統(tǒng)(JY04S-3C, 北京君意東方電泳設備有限公司)；其他試劑均為國產分析純。

1.2 生物信息軟件預測及保守性分析

1.2.1 miR-146a 在不同物種中的保守性分析 在miRBase數據庫(http://www.mirbase.org)中查詢并下載牛(Bostaurus)、人(Homosaspiens)、小鼠(Musmusculus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、黑猩猩(Gorillagorilla)、獼猴(Macacamulatta)、狗(dog)、雞(chicken)等8個物種的miR-146a成熟序列，再運用MEGA6.0軟件分析其保守性。

1.2.2 miR-146a靶基因預測 由于牦牛miRNA尚無合適的數據庫，因此選擇在牛miRNA數據庫中進行靶基因預測。利用生物信息學軟件TargetScan(http://www.targetscan.org)在線預測，以miR-146a 為miRNA，預測其靶基因，再從中挑選可能與哺乳動物卵巢卵泡生長發(fā)育相關的靶基因為研究對象。

1.3 牦牛Smad 4基因3′UTR野生型載體構建

1.3.1 引物設計和PCR擴增 根據GenBank ID: ENST00000398417.2確定的牛Smad4基因3′UTR區(qū)，再利用BLAST對基因序列及載體序列比對分析后,發(fā)現(xiàn)XhoI與NotI兩個限制性內切酶可以將目的片段克隆到載體中，因此選擇psiCHECK2載體(圖1)。設計合成特異引物(F：5′-CCGCTCGAGGGTCTTTTAACTTAACGTTG-3′；R：5′-ATAAGAATGCGGCCGCCGG TAAGATATTAGATGGAG -3′)，其中導入了XhoⅠ與NotⅠ內切酶酶切位點(引物斜體下劃線部分)，用于PCR擴增牦牛Smad4基因的 3′UTR，預期擴增目的片段總長度為1 123 bp。

以牦牛卵巢組織基因組DNA為模板，進行PCR擴增，反應體系為50 μL：2× KOD-FX Buffer 25 μL，dNTP 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1.5 μL，KOD-FX DNA聚合酶 1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 9 μL。反應條件：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃ 變性20 s,60 ℃ 退火 10 s，72 ℃延伸30 s，進行40個循環(huán)；72 ℃ 延伸7 min；4 ℃保存。PCR產物進行1%瓊脂糖電泳檢測確定特異性產物。

圖1 載體圖譜Fig.1 Vector map

1.3.2 擴增產物回收 按照Omega回收試劑盒說明書操作：200 μL PCR反應體積加入800 μL Buffer CP到1.5 mL離心管，劇烈震蕩，短暫離心；將上述混合物轉入吸附柱，13 000 r·min-1離心1 min，棄濾液；加入700 μL洗脫液，13 000 r·min-1離心1 min，棄濾液；加入500 μL洗脫液，13 000 r·min-1離心1 min，棄濾液；13 000 r·min-1離心2 min，甩去吸附柱上的殘留液體；把吸附柱轉移到一個新的1.5 mL離心管，在吸附柱中加入30 μL ddH2O，室溫放置1 min；13 000 r·min-1離心2 min，剩余濾液即是回收的DNA。

1.3.3 酶切和產物純化 用XhoⅠ與NotⅠ雙酶切Smad4啟動子基因的PCR產物和載體，酶切反應體系：10×FastDigest Green Buffer 2 μL，vector 10 μL，內切酶各1 μL，ddH2O補足到20 μL。反應條件：37 ℃ 4 h。酶切后按照上述1.3.2方法回收并純化酶切產物。

1.3.4 連接、轉化和菌落鑒定 取純化酶切產物進行連接反應，反應總體系為20 μL：10×Reaction Buffer 2 μL，Target 10 μL，Vector 5 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，ddH2O補足到20 μL。反應條件：16 ℃ 30 min。將連接產物加到100 μL Top10感受態(tài)細胞中混勻，冰浴30 min后置于42 ℃水浴90 s，取出后立即于冰浴中放置2 min, 加入800 μL 37 ℃ 預熱的LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，37 ℃振蕩培養(yǎng)45 min復蘇；8 000 r·min-1離心1 min，棄上清液，將100 μL混勻菌液加到含抗生素LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12～16 h長出菌落。

挑取上述平板上的單菌落，溶到3 μL水中，取0.5 μL做模板，按照上述步驟進行PCR擴增。試驗共挑取8個菌落，用載體上游和下游引物進行PCR反應，再用1%瓊脂糖電泳檢測擴增產物，然后將陽性克隆產物送北京信諾金達生物科技有限公司進行測序鑒定。

1.4 牦牛Smad 4基因3′-UTR突變型載體構建

利用突變PCR的方法, 將牦牛Smad4基因3′UTR 靶序列AGTTCTC突變?yōu)镃TGGAGA。突變引物F：5′-TGGTTAATAGTACATACTGTGAGAGCAAATGAA-3′；R：5′-CTCACAGTATGTACTATTAACCAGCTGCACAAC-3′。Smad4基因3′UTR 雙熒光素酶報告基因突變型載體(以下簡稱“Smad4-3′UTR-MT載體”)構建的基本過程: 以上述野生型載體(以下簡稱“Smad4-3′UTR-WT載體”)為模板, 分別擴增含突變序列的兩段序列,并進行拼接, 之后進行酶切、連接和轉化，最后突變載體同樣進行測序分析和擴增。

1.5 細胞培養(yǎng)與轉染

復蘇293T細胞，用細胞培養(yǎng)液(DMEM+10% FBS)培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2、95%相對濕度的培養(yǎng)箱中，經2～3次傳代，細胞生長狀態(tài)較好并呈對數生長期時，開始準備轉染。在96孔板中，每孔接種1×104個細胞，每孔加100 μL細胞培養(yǎng)液，放入37 ℃、5% CO2、95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后按照Lipofectamine 2000 轉染試劑說明書進行轉染：10 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋mimic或mimic NC，15 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋載體，25 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋lipo2000轉染試劑，室溫放置5 min。將三者輕輕吹打混合，靜置20 min 后，加入至細胞內。轉染6 h后更換為新鮮細

胞培養(yǎng)液。bta-miR-146a mimics/NC均由廣州市銳博生物科技有限公司合成。mimics轉染濃度為20 μmol·L-1，質粒濃度為100 ng?？偣苍O4個試驗組，分別為Smad4-3′UTR-WT與mimic共轉染組、Smad4-3′UTR-WT與mimic NC共轉染組、Smad4-3′UTR-MT與mimic共轉染組、Smad4-3′UTR-MT與mimic NC共轉染組，每組4個重復。

1.6 熒光素酶活性測定

轉染48 h后，各組細胞間用細胞裂解液裂解細胞，取5 μL 細胞裂解液與螢火蟲熒光素酶緩沖液及底物5 μL，混合測定熒光強度，然后加入海腎熒光素酶反應緩沖液及腔腸素底物5 μL，混勻再次測定海腎熒光素酶活性。每個樣品處理一致，比較海腎熒光素酶活性。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 bta-miR-146a保守性分析

利用miRBase數據庫(http://www.mirbase.org)中下載的牛(Bostaurus)、人(Homosaspiens)、小鼠(Musmusculus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、黑猩猩(Gorillagorilla)、獼猴(Macacamulatta)、狗(dog)、雞(chicken)8個物種的miR-146a成熟序列，再運用MEGA6.0軟件分析其保守性(表1)，結果發(fā)現(xiàn)，miR-146a的成熟序列在8個物種均為22個堿基，堿基基本一致，進一步表明miR-146a成熟序列在脊椎動物中具有高度的保守性。

2.2 bta-miR-146a 靶基因預測

采用TargetScan軟件，以牛數據庫為基礎，搜索miR-146a的靶基因，結果發(fā)現(xiàn)，bta-miR-146a存在248個潛在靶基因，其中有178個潛在靶基因在卵巢組織中表達(表2)，進一步分析發(fā)現(xiàn)，Smad4基因也是bta-miR-146a的一個潛在靶基因。前期研究發(fā)現(xiàn)，牦牛Smad4基因是一個表達譜很廣的基因，尤其在卵巢、輸卵管、子宮等組織中均有mRNA表達，而且牛Smad4基因3′UTR與bta-miR-146a在397～404 bp位置存在互補結合(圖2)，因此預測牦牛Smad4基因可能是bta-miR-146a的靶基因之一。

表1miR-146a在不同物種中的成熟序列比對分析

Table1ThealignmentofmaturemiR-146asequencesfrom8sepcies

物種 Species序列 Sequence牛 Bos taurusUGAGAACUGAAUUCCAUAGGUU人 Homo saspiensUGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU小鼠 Mus musculusUGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU大鼠 Rattus norvegicusUGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU獼猴 Macaca mulattaUGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU大猩猩 Gorilla gorillaUGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU狗 DogUGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU雞 ChickenUGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU

表2miR-146a靶基因相關信息

Table2Relatedinformationsofbta-miR-146atargetgenes

靶基因Target geneGenBank登錄號Accession number靶基因Target geneGenBank登錄號Accession number靶基因Target geneGenBank登錄號Accession numberABL2ENST00000502732.1KIAA0355ENST00000299505.6SGIP1ENST00000371036.3AMNENST00000299155.5KIF24ENST00000402558.2SLAMF8ENST00000289707.5AP1ARENST00000274000.5KLF4ENST00000374672.4SLC10A3ENST00000369649.4APPL1ENST00000288266.3KLF7ENST00000309446.6SLC39A1ENST00000356205.4ARENST00000374690.3KMT2DENST00000301067.7SLCO3A1ENST00000318445.6ATG7ENST00000354449.3KPNA6ENST00000373625.3SLITRK3ENST00000475390.1ATP5J2-PTCD1ENST00000413834.1LAYNENST00000525126.1SMAD4ENST00000398417.2BCORL1ENST00000540052.1LCORENST00000371103.3SMARCA5ENST00000283131.3BNC1ENST00000345382.2LRRC15ENST00000347624.3SMTNL2ENST00000338859.4BRD4ENST00000263377.2LSM11ENST00000286307.5SNX22ENST00000325881.4BRWD1ENST00000342449.3MAFFENST00000338483.2SNX24ENST00000513881.1BTG2ENST00000290551.4MAGOHBENST00000539554.1SORT1ENST00000256637.6CAMSAP1ENST00000389532.46-MarENST00000274140.5SOX5ENST00000546136.1CASKENST00000421587.2MARK1ENST00000366918.4SRRDENST00000215917.7CCDC6ENST00000263102.6MED1ENST00000300651.6SRRM4ENST00000267260.4CCNJENST00000265992.5MFHAS1ENST00000276282.6SRSF12ENST00000452027.2CDC14AENST00000370125.2MMP16ENST00000286614.6ST5ENST00000526757.1CELF1ENST00000395290.2MYOCDENST00000425538.1STK40ENST00000359297.2CNIH4ENST00000465271.1NAIF1ENST00000373078.4STRBPENST00000447404.2CNTFRENST00000351266.4NAP1L1ENST00000261182.8STRNENST00000263918.4CRNKL1ENST00000377327.4NF2ENST00000347330.5STXBP6ENST00000396700.1CUL4BENST00000371322.5NIPAL1ENST00000295461.5TAF9BENST00000341864.5DCAF12ENST00000361264.4NOVA1ENST00000465357.2TBC1D20ENST00000354200.4DCP1AENST00000607628.1NPAS4ENST00000311034.2TCF21ENST00000367882.4DDHD1ENST00000323669.5NRASENST00000369535.4TLCD2ENST00000330676.6DGCR14ENST00000252137.6NSD1ENST00000439151.2TLR4ENST00000355622.6

(轉下頁 Carried forward)

圖2 牛Smad 4基因3′UTR和bta-miR-146a相互結合靶位點預測Fig.2 Target point prediction for bovine Smad 4 gene 3′UTR to bta-miR-146a

2.3 牦牛Smad 4-3′UTR-WT載體構建

利用設計的特異性引物，以牦牛卵巢組織基因組DNA為模板PCR擴增Smad4基因3′UTR，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，然后對經過酶切、連接和轉化后的Smad4基因3′UTR載體菌落進行PCR擴增，用1%瓊脂糖檢測擴增產物。由圖3、圖4可知，PCR擴增產物在1 000～2 000 bp 之間出現(xiàn)特異性條帶，并且其大小與預期片段大小一致。將陽性克隆產物送公司測序，測序結果(圖5)證實牦牛Smad4基因3′UTR靶序列AGTTCTC成功地插入雙熒光素酶報告載體psiCHECK2中，此Smad 4-3′UTR-WT載體可以用于熒光素酶活性的檢測。

M. DNA 相對分子質量標準；1～2. PCR擴增產物N. DNA marker DL2000;1-2. PCR products of yak Smad 4 gene 3′UTR圖3 牦牛Smad 4基因3′UTR區(qū)RT-PCR電泳圖Fig.3 RT-PCR electrophoresis of yak Smad 4 gene 3′UTR

M. DNA 相對分子質量標準；1～8. 菌落擴增產物 N. DNA marker DL2000;1-8. Colonies amplification products圖4 牦牛Smad 4基因載體菌落RT-PCR電泳圖Fig.4 RT-PCR electrophoresis of yak Smad 4 vector colonies

2.4 牦牛Smad 4-3′UTR-MT載體構建

以牦牛Smad 4-3′UTR-WT載體為模板，進行PCR反應，擴增含突變序列的兩段序列并進行拼接，之后進行酶切、連接、轉化、提取質粒，并進行測序分析，測序結果證實牦牛Smad4基因3′UTR靶序列AGTTCTC突變?yōu)镃TGGAGA(圖5)，此Smad 4-3′UTR-MT載體構建成功，可以用于后續(xù)熒光素酶活性的檢測。

2.5 雙熒光素酶活性檢測結果

將牦牛Smad4基因3′UTR野生型/突變型載體與bta-miR-146a mimics/NC共轉染293T細胞后，檢測雙熒光素酶活性。由圖6可知，Smad 4-3′UTR-WT+ mimic組的熒光素酶活性顯著低于 Smad 4-3′UTR-WT+ mimic NC組(P<0.05)，而Smad 4-3′UTR-MT+ mimic組的熒光素酶活性與 Smad 4-3′UTR-MT+ mimic NC組差異不顯著(P>0.05)。此結果表明，bta-miR-146a對Smad 4-3′UTR-WT的熒光素酶活性有顯著抑制作用，而bta-miR-146a對Smad 4-3′UTR-MT的熒光素酶活性沒有顯著影響。

3 討 論

miRNA是一類內源性的非編碼RNA，大小為18～24個核苷酸，主要通過堿基互補配對的方式識別靶基因，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶基因或者阻遏靶基因的翻譯[25]。有研究表明，miRNA對卵泡和卵母細胞的生長、成熟有不可替代的作用[26]。在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-383能促進顆粒細胞增殖、激素分泌[18]；miR-224能促進顆粒細胞增殖[28-29]、激素分泌以及芳香酶表達[30]，延遲卵丘卵母細胞成熟[31]；miR-145能抑制顆粒細胞的增殖[21]；miR-146能經過視黃酸信號途徑調控精原細胞分化[32]。在豬的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-26b抑制芳香酶表達和激素分泌，并且促進顆粒細胞的凋亡[22]。我們先前通過PCR半定量方法檢測了Smad4基因和miRNA在牦牛各組織中的表達情

A. Smad 4-3′UTR-WT載體序列；B. Smad 4-3′UTR-MT載體序列A. Sequence of Smad 4-3′UTR-WT; B. Sequence of Smad 4-3′UTR-MT圖5 牦牛Smad 4基因3′UTR構建載體序列測序圖Fig.5 Yak Smad 4 gene 3′UTR vector sequencing map

各組間，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Different letters indicate significant differences(P<0.05), the same letter indicate no significant difference(P>0.05) among different groups圖6 雙熒光素酶活性檢測結果Fig.6 The results of dual-luciferase activity assay

況，結果發(fā)現(xiàn)，Smad4在牦牛卵巢、輸卵管和子宮等生殖組織中均有表達，而且bta-miR-146a在牦牛卵巢組織中表達量較高，推測Samd4基因是bta-miR-146a的靶基因[27]。因此本試驗首先利用miRBase數據庫和MEGA 6.0分析了miR-146a成熟序列在牛、人、小鼠、大鼠、黑猩猩、獼猴、狗和雞等8個物種中的保守性，結果發(fā)現(xiàn)，miR-146a成熟序列在脊椎動物中具有高度的保守性，暗示miR-146a在基本生命過程中發(fā)揮著一定的生物學功能。然后采用TargetScan軟件，以牛數據庫為基礎，搜索miR-146a的靶基因并且分析bta-miR-146a與靶基因的結合位點，結果發(fā)現(xiàn)，Smad4是bta-miR-146a的248個潛在靶基因之一，而且Smad4基因3′UTR區(qū)AGUUCUC序列與bta-miR-146a成熟序列UCAAGAG存在保守的互補結合位點，更進一步提示Smad4基因可能是bta-miR-146a的靶基因之一。

在哺乳動物中，Smads蛋白是將轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號傳導至細胞核的介導蛋白，在TGF-β信號傳導過程中起著關鍵性作用[33-34]。目前已發(fā)現(xiàn)9種哺乳動物的Smads蛋白，根據功能不同分為受體激活型Smad蛋白(recepter activated smad，R-Smad)、抑制型Smad蛋白(inhibitory smads，I-Smads)和通用調節(jié)型Smad蛋白(common mediator smads，Co-Smads)，其中Smad 4為唯一Co-Smads蛋白[35-36]。在TGF-β信號傳導過程中，R-Smad首先被激活的受體磷酸化，然后與Smad 4結合形成異源性聚合體，進入細胞核，從而調控目的基因的表達[33,37]。當敲除Smad4基因時會阻斷信號傳導通路，使上游信號分子所攜帶的信息無法正常傳遞至細胞核，從而導致細胞損傷[19, 38-39]。故Smad4在TGF-β信號傳導過程中起著中樞性作用[3, 33,37]。而且現(xiàn)研究也已證明，Smad4基因在小鼠多種組織中發(fā)揮著重要作用，例如，Smad4基因在卵巢中表達廣泛，其中在卵泡中表達更加明顯，而且隨著卵巢的成熟，表達量逐漸上升[40]；當敲除心內膜中Smad4基因會導致上皮細胞轉化功能受阻、心內膜細胞增殖停止和心室心內膜結構異型等癥狀，從而影響心正常生長發(fā)育[41]；敲除胚胎平滑肌細胞Smad4基因會對平滑肌細胞分化、增殖、遷移等產生影響，從而導致胚胎心血管機能不全[42]；當敲除表皮Smad4基因會使毛囊干細胞持續(xù)性激活消耗，從而導致皮膚腫瘤形成[43]；當特異性敲除Smad4基因后小鼠排卵數、產仔數等生殖能力隨時間而逐漸下降，并且有腔卵泡明顯減少，閉鎖卵泡大大增加，表明Smad4基因在小鼠卵巢卵泡發(fā)育過程中確實發(fā)揮著關鍵性作用[19,39]。

為了驗證牦牛Smad4基因與bta-miR-146a的靶向關系，本研究以牦牛卵巢基因組DNA為模板，克隆Smad4基因3′UTR區(qū)，并將結合序列AGTTCTC和突變序列CTGGAGA插入雙熒光素酶報告載體psiCHECK2中，從而構建Smad4-3′UTR-WT和Smad4-3′UTR-MT載體，再通過載體與miRNA共轉染細胞后，檢測雙熒光素酶活性，結果發(fā)現(xiàn)，bta-miR-146a可以直接與Smad4基因3′UTR區(qū)的部分堿基互補配對結合，表明Smad4基因是bta-miR-146a的靶基因。這在理論上直接證明bta-miR-146a可以抑制Samd4基因表達，此結果為進一步探索bta-miR-146a在牦牛卵巢卵泡發(fā)育中的功能奠定了理論基礎。

4 結 論

本試驗先利用miRBase數據庫和MEGA 6.0軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-146a具有高度的保守性，再利用TargetScan軟件成功預測到Smad4基因是bta-miR-146a的潛在靶基因之一，而且其3′UTR區(qū)部分序列與bta-miR-146a存在結合位點。然后通過成功構建Smad4基因3′UTR區(qū)雙熒光素酶報告基因載體，初步證實Smad4基因是bta-miR-146a的靶基因，從而提示bta-miR-146a在牦牛卵泡發(fā)育過程中可能通過調控Smad4基因發(fā)揮作用，但有待深入研究。