張會永，吳井生，李國輝，俞 燕，楊劍波，蘇一軍，殷建玫，韓 威*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，揚(yáng)州 225125；2.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，句容 212400)

禽白血病(avian leukosis，AL)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科禽白血病/肉瘤病毒群病毒(avian leukosis/sarcoma virus，ALV)引起的禽類(主要是雞)各種良性和惡性腫瘤的一類疾病。禽白血病病毒依據(jù)病毒囊膜糖蛋白的抗原差異、病毒干擾試驗、宿主范圍和基因組分子生物學(xué)特性將其劃分為10個亞群(A～J亞群)[1-2]和新發(fā)現(xiàn)的K亞群[3]，其中A、B、C、D、J亞群屬于外源性病毒，對雞生產(chǎn)影響較為嚴(yán)重的是A、B和J亞群[4-6]。

ALV可水平和垂直傳播[7-8]。水平傳播主要通過出雛和育雛期羽毛、糞便等接觸傳播，整個飼養(yǎng)過程中疫苗免疫也是主要傳播途徑之一。已有的研究表明，ALV可通過母雞和公雞進(jìn)行垂直傳播，但是，公雞、母雞在ALV垂直傳播給下一代所起到的作用至今沒有相關(guān)報道。Tsukamoto等[9]研究發(fā)現(xiàn)ALV可通過母雞輸卵管傳播給胚胎，Payne和Nair[10]報道也表明ALV-A、ALV-B和ALV-J均可通過母雞垂直傳播給后代。Segura等[11]、Smith和Fadly[12]研究認(rèn)為禽白血病病毒不能在公雞的生殖器官中增殖，公雞僅作為病毒載體，在交配過程中傳播給后代。張培培[13]在仿土蛋雞群J亞型禽白血病病毒的感染狀態(tài)評估及其來源探究中發(fā)現(xiàn)，后代分離到的ALV-J毒株與其父本ALV-J分離株的gp85基因序列相似性達(dá)98.5%～99.7%，表明其來源于父本。俞燕等[14-16]在地方雞種公雞精液檢測中發(fā)現(xiàn)有ALV，Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)公雞可通過精液將ALV垂直傳播給后代。

針對雞遺傳資源保種場、基因庫而言，由于單個保種群規(guī)模較小(一般30～40個家系，搶救性保護(hù)群體數(shù)量更少)，若淘汰全部帶毒個體或家系(尤其是數(shù)量較少的公雞)，會導(dǎo)致群體規(guī)模驟減，造成遺傳多樣性丟失和近交系數(shù)過快增加?；诖?，我們以惠陽胡須雞和汶上蘆花雞為素材，對陽性公、母雞垂直傳播特性進(jìn)一步驗證探討，旨在為優(yōu)化種禽場、保種場禽白血病凈化方案提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

惠陽胡須雞和汶上蘆花雞均來源于國家級地方雞種基因庫(江蘇)，43周齡時進(jìn)行禽白血病血液和精液病毒分離檢測，篩選個體組建以下試驗組：(1)陽性惠陽胡須雞♂×陰性汶上蘆花雞♀(♂3只，血液病毒分離S/P值分別為0.877、1.856、4.328；♀分3小 組，每組8只)；(2)血液和精液病毒分離檢測均為陰性的汶上蘆花雞♂×陽性惠陽胡須雞(♂為3只，♀為3小組，S/P值分別在0.2～1、1～2、>2，每組8只)；(3)對照組，陰性蘆花公雞♂×陰性汶上蘆花雞♀(8只)，具體見表1。實驗雞群人工輸精，每個母雞個體單獨一個輸精槍頭，收集種蛋12 d。種蛋標(biāo)記，孵化盒分裝孵化，雛雞隔離飼養(yǎng)。

1.2 樣品采集與處理

43周齡采集惠陽胡須雞和汶上蘆花雞無菌抗凝血1.5 mL，并同時采集精液。對試驗組后代采集1日齡胎糞，42日齡泄殖腔拭子、無菌抗凝血血液，死亡實驗雞群的肝組織。胎糞和泄殖腔拭子：檢測前反復(fù)凍融3次，靜置取上清。血液、精液和肝組織處理及其病毒分離見參考文獻(xiàn)[14，18-19]。

表1實驗公母雞分組情況

Table1Groupingsituationofroostersandhens

組別Groups公雞RoostersS/P值S/P value母雞HensS/P值S/P value陽性♂×陰性♀A陽性惠陽胡須雞0.877×陰性蘆花雞8只—B陽性惠陽胡須雞1.856×陰性蘆花雞8只—C陽性惠陽胡須雞4.328×陰性蘆花雞8只—陰性♂×陽性♀D陰性蘆花雞—×陽性惠陽胡須雞8只0.2～1E陰性蘆花雞—×陽性惠陽胡須雞8只1～2F陰性蘆花雞—×陽性惠陽胡須雞8只>2陰性♂×陰性♀G陰性蘆花雞—×陰性蘆花雞8只—

1.3 p27抗原ELISA檢測

血漿病毒分離細(xì)胞上清，“1.2”中收取的毒液，凍融后的胎糞與泄殖腔拭子上清，用ALV p27抗原試劑盒檢測，具體操作按照IDEXX公司ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 前病毒cDNA的制備

根據(jù)病毒分離ELISA檢測結(jié)果，收取陽性的DF-1細(xì)胞沉淀，按 OMEGA 公司 SQTISSUE組織 DNA 試劑盒說明書制備前病毒基因組cDNA，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 分離株env基因的PCR擴(kuò)增和序列分析

針對env基因設(shè)計并合成一對通用引物，用于擴(kuò)增ALV囊膜蛋白env基因約2.6 kb片段(上游引物5′-CGAGAGTGGCTCGCGAGATGG-3′；下游引物5′-ACACTACATTTCCCCCTCCCTAT-3′)。以前病毒基因cDNA為模板，PCR擴(kuò)增ALV囊膜蛋白env基因，片段大小約2.6 kb。陰性對照為DF-1細(xì)胞DNA，陽性對照為ALV-J NX0101株。反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性7 min；95 ℃變性50 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，32個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用TaKaRa公司DL5000 Marker，產(chǎn)物回收、純化后擴(kuò)增克隆至pMD18-T載體中測序。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS16.0t檢驗對p27抗原陽性率進(jìn)行比較分析，采用Blast和MEGA4.0程序進(jìn)行序列比對和聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 陽性公、母雞后代ALV檢測結(jié)果

后代ALV檢測結(jié)果(表2)表明，陽性公雞后代的胎糞p27抗原陽性率為23.49%，42日齡泄殖腔拭子p27抗原陽性率為36.60%，42日齡病毒分離陽性率為8.54%；陽性母雞后代的胎糞p27抗原陽性率為12.42%，42日齡泄殖腔拭子p27抗原陽性率為19.89%，42日齡病毒分離陽性率為0%；陽性公雞后代的胎糞、泄殖腔拭子和病毒分離陽性率顯著高于陽性母雞后代。

2.2 病毒分離檢測陽性雞S/P值高低與后代ALV檢測陽性率的相關(guān)性

病毒分離檢測S/P值高低與后代ALV檢測陽性率的相關(guān)性分析結(jié)果(表3)表明，輸精個體S/P值的高低與后代陽性率無相關(guān)性(P>0.05)。

2.3 胎糞、泄殖腔拭子與病毒分離p27抗原檢測陽性率比較

對胎糞、泄殖腔拭子與病毒分離p27抗原檢測陽性率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)當(dāng)公雞為陽性時，在后代胎糞檢測為陰性群體中，病毒分離檢測卻檢測到3個陽性個體，胎糞檢測陽性個體與病毒分離檢測陽性個體的符合率為85%。說明胎糞檢測有一定的漏檢率。42日齡棉拭子檢測的陽性個體與病毒分離陽性個體的陽性符合率為100%。

2.4 病毒分離陽性個體env基因的PCR擴(kuò)增和測序

ALVenv基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小在2 600 bp左右，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

2.5 分離株env基因核苷酸序列分析

利用Blast對分離株env的gp85基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果表明，測序序列與已報道的ALV-J亞型序列(登錄號AF247385.1、KF796647.1、KT598484.1、GU222401.1、KT598483.1、JX855935.1)相似性>95%。該分離株的gp85序列與A、B、J亞型參考株的gp85基因序列進(jìn)行遺傳演化分析，如圖2中顯示，該序列與J亞型聚在同一分支，進(jìn)一步證明該毒株為J亞型。

表2陽性公、母雞后代p27抗原檢測

Table2p27antigendetectionresultofALV-positiveroostersandhens

指標(biāo) Index陽性公雞后代Offsprings of ALV-positive roosters陽性母雞后代Offsprings of ALV-positive hens組別Group陽性率/% Positive rate組別Groups陽性率/%Positive rate胎糞p27抗原A22.50(18/80)D12.50(8/64)p27 antigen from meconiumB21.05(16/76)E12.70(8/63)C26.92(21/78)F12.07(7/58)x23.49±0.03*x12.42±0.00泄殖腔拭子p27抗原A36.36(28/77)D19.05(12/63)p27 antigen from cloacal swabsB34.25(25/73)E20.97(13/62)C39.19(29/74)F19.64(11/56)x36.60±0.01*x19.89±0.01病毒分離p27抗原A8.75(7/80)D0(0/63)p27 antigen from plasmaB7.89(6/76)E0(0/63)C8.97(7/78)F0(0/58)x8.54±0.01*x0

陽性公雞后代與陽性母雞后代相比，*.P<0.05(t檢驗)

Compared with offsprings of ALV-positive hens, *.P<0.05 (ttest)

表3陽性公、母雞43周齡病毒分離S/P值與其后代ALV陽性率的相關(guān)性分析

Table3CorrelationanalysisofamountofALVcarriedorshedbyALV-positiveroostersandhensandpositiverateofp27antigenintheiroffsprings

動物及相關(guān)性分析Animal and correlation analysisS/P值S/P value胎糞p27抗原陽性率/%Positive rate of p27 antigen from meconium泄殖腔拭子p27抗原陽性率/%Positive rate of p27 antigen from cloacal swabs病毒分離p27抗原陽性率/%Positive rate of p27 antigen from plasm陽性公雞0.87722.50(18/80)36.36(28/77)8.75(7/80)Positive roosters1.85621.05(16/76)34.25(25/73)7.89(6/76)4.32826.92(21/78)39.19(29/74)8.97(7/78)相關(guān)性分析 Correlation analysisP>0.05P>0.05P>0.05陽性母雞0.2～112.50(8/64)19.05(12/63)0(0/63)Positive hen1～212.70(8/63)20.97(13/62)0(0/63)>212.07(7/58)19.64(11/56)0(0/58)相關(guān)性分析Correlation analysisP>0.05P>0.05P>0.05

3 討 論

3.1 試驗組個體與檢測時間點的選擇

本試驗開展的前提基礎(chǔ)是能準(zhǔn)確篩選出陽性雞個體和陰性雞個體。根據(jù)發(fā)病雞的表型和實驗室檢測可準(zhǔn)確檢測出禽白血病陽性個體，但是陰性個體確定十分困難。為確保試驗的準(zhǔn)確性，惠陽胡須雞陽性個體確定是通過43周齡血液病毒分離檢測陽性結(jié)果，結(jié)合試驗后期病癥解剖觀測；汶上蘆花雞陰性個體是通過43周齡血液病毒陰性結(jié)果，結(jié)合家系病史追溯，要求篩選出的陰性個體上3個世代家系內(nèi)沒有出現(xiàn)禽白血病個體。

在前期工作中對地方雞種進(jìn)行了排毒規(guī)律摸索，發(fā)現(xiàn)5周齡排毒量最高[18]，結(jié)合生產(chǎn)的需要(6周齡進(jìn)行篩選雞群進(jìn)行轉(zhuǎn)群)，試驗確定在6周齡對試驗組后代個體進(jìn)行禽白血病病毒分離檢測。通過PCR擴(kuò)增測序和遺傳聚類分析，確定本試驗個體感染毒株為J亞型禽白血病病毒。

3.2 ALV通過陽性公雞(母雞)傳播后代的規(guī)律

趙鵬等[20]研究發(fā)現(xiàn)種蛋中禽白血病病毒p27抗原檢出率與雞群禽白血病發(fā)病率呈正相關(guān)。本試驗結(jié)果進(jìn)一步驗證了ALV可通過公雞精液傳播給后代，且公雞在ALV傳播給后代過程中起重要作用。

M. DL5000相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5. ALV env基因擴(kuò)增產(chǎn)物M. DL5000 marker；1-5. Amplification products of ALV env圖1 ALV env基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of ALV env

△.本研究分離毒株序列；○.ALV-B gp85基因序列；□.ALV-A gp85基因序列△.Sequence of isolated strain in this study；○.gp85 gene sequence of ALV-B；□. gp85 gene sequence of ALV-A圖2 不同亞型禽白血病毒株gp85基因序列的遺傳演化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of gp85 gene sequence of avian leukosis viruses strains subtype A，B and J

試驗發(fā)現(xiàn)禽白血病陽性公雞后代病毒分離的陽性率為8.54%，禽白血病陽性母雞后代沒有發(fā)現(xiàn)陽性個體；且陽性公雞后代的胎糞p27抗原、泄殖腔拭子p27抗原與血液病毒分離陽性率顯著高于陽性母雞后代。該研究結(jié)果進(jìn)一步驗證了張培培等[13，17]的研究結(jié)果，更進(jìn)一步得出了陽性公雞對ALV的垂直傳播影響較大的結(jié)論。對于在陽性母雞后代中沒有發(fā)現(xiàn)陽性個體，分析主要有幾方面原因：一是品種原因，不同品種對ALV的易感性不同；且本試驗是雜交試驗，有可能增強(qiáng)了雞的抵抗力；二是本試驗并非SPF雞，雞本身存在抗體；三是采取了母雞單個輸精槍頭；四是可能與檢測的時間點有關(guān)；課題組對試驗雞群將繼續(xù)飼養(yǎng)檢測進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

試驗結(jié)果提示在禽白血病凈化過程中，應(yīng)加大對公雞的檢測力度，建議采取血液病毒分離和精液病毒分離相結(jié)合的方法[17]。

3.3 陽性雞S/P值大小對后代陽性率影響

本試驗禽白血病檢測使用的ELISA試劑盒，其陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為S/P>0.2。S/P值高低與后代陽性率是否存現(xiàn)相關(guān)性，相關(guān)報道較少。郝建勇等[15]研究表明，在蛋清ELISA檢測時，S/P值高低與對應(yīng)母雞外源性ALV病毒血癥有一定的相關(guān)性。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)43周齡血液病毒分離檢測為陽性個體的S/P值高低與后代的陽性率沒有顯著的相關(guān)性。

3.4 不同檢測方法陽性率比較

針對胎糞、泄殖腔拭子的假陽性和漏檢等研究報道很多，陳俊霞等[21]研究發(fā)現(xiàn)，胎糞p27抗原檢測和泄殖腔拭子p27抗原檢測均有較高的假陽性，并且有一定的漏檢。俞燕等[18]也發(fā)現(xiàn)泄殖腔拭子有較高的假陽性，且有漏檢。

本試驗發(fā)現(xiàn)，胎糞p27抗原與泄殖腔棉拭子p27抗原檢測存在較高的假陽性，尤其是泄殖腔棉拭子p27抗原檢測假陽性較高。在胎糞p27抗原檢測陰性個體中，血液病毒分離p27抗原檢測出現(xiàn)了3個陽性個體，胎糞檢測漏檢率為15%。42日齡泄殖腔拭子p27抗原檢測結(jié)果與病毒分離檢測符合率為100%。對禽白血病進(jìn)行凈化，一般情況下，前期檢測(胎糞、42日齡血液病毒分離)采取的是家系淘汰法，即一個個體為陽性，家系后代全部淘汰，增加了凈化工作量和成本。因此建議不進(jìn)行胎糞及泄殖腔拭子ALV檢測。

在AL的防控中，除了對種群進(jìn)行ALV檢測及時淘汰陽性個體，還應(yīng)制定嚴(yán)格的飼養(yǎng)管理措施。孵化、育雛、疫苗免疫、輸精等是影響禽白血病水平傳播的重要途徑，生產(chǎn)中對新疫苗及時進(jìn)行禽白血病檢測，疫苗注射在不同品種間換針頭，多品種一起繼代繁殖時，每個品種(家系)使用固定的輸精杯，陽性率高、低品種分開孵化出雛。

4 結(jié) 論

在地方品種惠陽胡須雞和汶上蘆花雞中，ALV陽性公雞后代的陽性率顯著高于陽性母雞后代，血液病毒分離檢測陽性雞S/P值高低與后代陽性率沒有顯著相關(guān)性，ALV胎糞檢測和泄殖腔棉拭子具有較高的假陽性率。研究結(jié)果為進(jìn)一步制定更合理的禽白血病凈化方案提供了理論依據(jù)。