尹衛(wèi)芹 ，許世清 ，翟 敏 ，王 在 ，婁晉寧 ?

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 研究生院，北京 100730；2.中日友好醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是引起終末期腎臟疾病的主要原因，也是導(dǎo)致糖尿病患者生活質(zhì)量下降及高死亡率的的主要原因[1，2]。長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致還原糖在非酶促作用下與蛋白氨基反應(yīng)形成的復(fù)合物，經(jīng)過(guò)一系列的結(jié)構(gòu)重組及脫水，產(chǎn)生了糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）[3～5]。 AGEs 在糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，我們前期研究發(fā)現(xiàn)其不僅損傷腎小球而且影響腎小管的功能。

胰高糖素樣肽 1（glucagon-like peptide 1，GLP-1）是主要由腸道分泌的一種腸源性激素，在進(jìn)食后促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素[6]，是目前臨床治療2型糖尿病的輔助藥物。近年來(lái)多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)其對(duì)糖尿病腎病也具有一定療效：Ren X等人曾發(fā)現(xiàn)GLP-1可減輕糖尿病動(dòng)物的腎小球病變[7]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)GLP-1也可以減輕糖尿病大鼠的腎小管損害，其機(jī)制之一可能是減輕了腎間質(zhì)的炎癥反應(yīng)[8]。但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不能完全排除GLP-1降糖作用對(duì)腎臟的保護(hù)作用，因此，本研究利用體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞系HK-2細(xì)胞，用AGEs培養(yǎng)模擬糖尿病狀態(tài)，分析GLP-1對(duì)腎小管上皮的直接作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要材料及試劑

人近端腎小管上皮細(xì)胞 （human proximal tubular epithelial cells，HK-2）（本實(shí)驗(yàn)室自存）。GLP-1（7-36）（上海華依科技發(fā)展股份有限公司惠贈(zèng)）。AGEs（Abcam公司，英國(guó)）。甘精胰島素（Insulin， 賽諾菲公司，法國(guó)）。 兔抗 PKA、PKC-β、iNOS、SOD-1抗體（Abcam 公司，英國(guó)）。鼠抗 βactin抗體、辣根過(guò)氧化物酶 （HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記兔抗鼠 IgG（Sigma公司，上海）。

1.2 細(xì)胞分組及處理

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞分成4組，培養(yǎng)基使用5%血清的M199培養(yǎng)基，各組分別添加藥物情況如下：對(duì)照組（N）：不添加任何藥物；AGEs組：添加AGEs終濃度為 400μg/ml；AGEs+GLP-1組： AGEs 400μg/ml+GLP-1 10-8M；和 AGEs+Insulin組： AGEs 400μg/ml+Insulin 1IU/ml。 各組細(xì)胞均培養(yǎng)24h后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。檢測(cè)PKA和PKC通路的干預(yù)作用時(shí)，另外設(shè)AGEs+GLP-1+PKCa組：在AGEs+GLP-1組處理前30min給予PKC激動(dòng)劑 PMA 200nM；AGEs+GLP-1+PKAi組：在AGEs+GLP-1組處理前30min給予PKA抑制劑H-89 10μM。

1.3 HK-2細(xì)胞白蛋白吸收能力的檢測(cè)

將人HK-2細(xì)胞接種于96孔板，按上述分組，每組設(shè)4個(gè)平行孔，處理細(xì)胞24h，然后將FITC標(biāo)記的白蛋白加入到培養(yǎng)基內(nèi)，終濃度20μg/ml，孵育 30min。 PBS 洗 3 次，每次 3min，徹底洗去培養(yǎng)基中的白蛋白。每孔添加100μl基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，使用連續(xù)光譜熒光儀檢測(cè)各孔細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，并用每孔細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以避免細(xì)胞數(shù)量不同導(dǎo)致的誤差，通過(guò)比較熒光強(qiáng)度/μg蛋白，分析各組細(xì)胞在同樣數(shù)量下對(duì)白蛋白的吸收能力。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

收獲細(xì)胞，按Trizol說(shuō)明書提取各組細(xì)胞總RNA，按TaKaRa公司說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用SYBR染料法在ABI7500系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。所用引物見表1?？偡磻?yīng)體積25μl，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃2min，擴(kuò)增條件為95℃5s、60℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)。

1.5 Western blot檢測(cè)

使用SDS裂解液提取細(xì)胞總蛋白，每孔加入40μg細(xì)胞總蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGEs分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF 膜 1h，分別加入抗 PKC-β（1：1000）、 PKA（1：1000）、SOD-1 （1：800）、iNOS （1：800） 和 βactin（1：10000）抗體，4℃過(guò)夜。 洗膜后加入 HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（1：5000）和 HRP 標(biāo)記兔抗鼠（1：5000）的二抗，室溫孵育1h。洗膜后加入ECL化學(xué)發(fā)光劑，凝膠成像系統(tǒng)顯影。

表1 PCR擴(kuò)增的引物

圖1 B 連續(xù)光譜熒光儀測(cè)定結(jié)果

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 GLP-1對(duì)AGEs處理的人HK-2細(xì)胞白蛋白吸收能力的影響

熒光顯微鏡下可觀察到：HK-2細(xì)胞經(jīng)AGEs處理后，細(xì)胞吸收白蛋白的能力明顯低于正常對(duì)照組，同時(shí)給予GLP-1組，HK-2細(xì)胞仍維持較好的白蛋白吸收能力，與對(duì)照組無(wú)差別，但同時(shí)給予AGEs和Insulin組與AGEs組的白蛋白吸收能力相似（圖1A，封二）。應(yīng)用連續(xù)光譜熒光儀測(cè)定各孔細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，為避免因各組細(xì)胞數(shù)量不同導(dǎo)致誤差，用每孔細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，熒光強(qiáng)度的結(jié)果與鏡下觀察的一致（圖1B）。

2.2 GLP-1對(duì)HK-2細(xì)胞上Megalin和Cubilin表達(dá)的影響

在 AGEs處理組，Megalin（圖 2A）和 Cubilin（圖2B）的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平表達(dá)均明顯低于正常對(duì)照組。同時(shí)給予AGEs和GLP-1組，HK-2細(xì)胞內(nèi)Megalin和Cubilin的表達(dá)明顯高于AGEs處理組。但同時(shí)給予Insulin組與AGEs組無(wú)顯著性差異（圖2）。

2.3 GLP-1對(duì)AGEs處理的HK-2細(xì)胞內(nèi)PKA和PKC-β表達(dá)的影響

在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PKA（圖3A）和PKC（圖3B）水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，AGEs處理組的PKA 表達(dá)明顯降低（P＜0.05），而 PKC-β 的表達(dá)明顯升高。與AGEs處理組相比，AGEs+GLP-1處理組的PKA表達(dá)明顯升高，PKC-β的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。 然而，AGEs+Insulin 處理組與 AGEs組無(wú)顯著性差異。提示GLP-1可部分阻斷AGEs的作用，但I(xiàn)nsulin無(wú)顯著效果。

2.4 GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)的人HK-2細(xì)胞內(nèi)iNOS和SOD-1表達(dá)的影響

圖2 GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)的HK細(xì)胞內(nèi)Megalin和Cubilin表達(dá)的影響

通過(guò)RT-PCR和Western blot發(fā)現(xiàn)，iNOS在正常HK-2上有基礎(chǔ)表達(dá)，給予AGEs處理后表達(dá)明顯增加。與AGEs組相比，GLP-1+AGEs組的表達(dá)明顯降低，而AGEs＋I(xiàn)nsulin組表達(dá)無(wú)顯著變化（圖4A）。同時(shí)，AGEs組的SOD-1表達(dá)明顯低于正常組，且與AGEs組相比，GLP-1+AGEs組的SOD表達(dá)顯著升高，而AGEs+Insulin組的表達(dá)無(wú)顯著變化（圖4B）。

2.5 PKC抑制劑和PKA激活劑對(duì)人HK-2細(xì)胞內(nèi)iNOS和SOD-1表達(dá)的影響

圖3 GLP-1對(duì)AGEs處理的人HK-2細(xì)胞內(nèi)PKA和PKC-β表達(dá)的影響

圖4 GLP-1對(duì)AGEs處理的人HK-2細(xì)胞內(nèi)iNOS和SOD-1表達(dá)的影響

圖5 干預(yù)PKA或PKC通路對(duì)GLP-1調(diào)節(jié)iNOS和SOD-1表達(dá)的影響

為分析PKA和PKC的表達(dá)變化是否參與GLP-1對(duì)iNOS和SOD的調(diào)節(jié)，在AGEs+GLP-1組的基礎(chǔ)上分別給予PKA抑制劑和PKC激動(dòng)劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予干預(yù)后，GLP-1對(duì)iNOS（圖5A）和SOD（圖5B）的影響被部分阻斷。提示GLP-1通過(guò)影響PKA和PKC通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。

3 討論

生理?xiàng)l件下，GLP-1調(diào)節(jié)了機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)和能量代謝。自從GLP-1類藥物被用于糖尿病的治療后，對(duì)其作用的研究越來(lái)越深入，由于GLP-1通過(guò)與其受體結(jié)合發(fā)揮作用，而目前發(fā)現(xiàn)GLP-1的受體在腎臟組織中有較高水平的表達(dá)，因此，GLP-1在糖尿病腎病中的作用日益受到關(guān)注[9]。為分析GLP-1的作用是否不依賴于促胰島素分泌而是直接作用于腎臟，本研究采用HK-2細(xì)胞研究了GLP-1對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的直接作用。

糖尿病腎病時(shí)，患者尿白蛋白的產(chǎn)生不僅由于腎小球的濾過(guò)作用受損，也與近端腎小管對(duì)白蛋白的重吸收作用降低有關(guān)[10]。通過(guò)觀察HK-2細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記的白蛋白的吸收作用，我們發(fā)現(xiàn)GLP-1可以防止AGEs處理導(dǎo)致的HK-2細(xì)胞白蛋白吸收能力的降低。近端腎小管上皮細(xì)胞對(duì)白蛋白重吸收的作用是通過(guò)2個(gè)蛋白受體Megalin和Cubilin完成[11]。這2個(gè)蛋白受體表達(dá)的改變，能夠影響近端腎小管對(duì)白蛋白吸收作用[12，13]。在本研究中，我們的結(jié)果證實(shí)GLP-1保護(hù)了HK-2細(xì)胞內(nèi)與近端腎小管蛋白重吸收2個(gè)蛋白受體Megalin和Cubilin的表達(dá)水平，因此維持細(xì)胞對(duì)白蛋白的正常吸收功能。

我們前期對(duì)糖尿病腎間質(zhì)病變的研究發(fā)現(xiàn)，PKA的降低和PKC的升高參與糖尿病腎病的發(fā)生，并且與腎小管的重吸收功能有關(guān)。由于PKA和PKC與引起糖尿病腎病損傷的氧化應(yīng)激密切相關(guān)[14，15]，因此，我們隨后檢測(cè)了 GLP-1 對(duì) PKA、PKC以及氧化應(yīng)激的影響，結(jié)果證實(shí)，GLP-1可減輕AGEs處理后HK-2細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，且機(jī)制與GLP-1升高PKA和降低PKC水平有關(guān)。

本研究結(jié)果提示，糖尿病時(shí)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)PKA和PKC等多條信號(hào)通路活性發(fā)生改變，而GLP-1可直接作用于腎小管上皮細(xì)胞，通過(guò)調(diào)節(jié)PKA和PKC信號(hào)通路，維持細(xì)胞對(duì)白蛋白的正常重吸收功能，從而減輕蛋白尿。