李佳靜,王炎秋,卞崔冬,萬曉東,相 俊

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院教學(xué)輔助中心,上海 200020;2.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,上海 200065;3.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科,上海 200065

國際衛(wèi)生組織2015年的數(shù)據(jù)表明,成年人中有23億超重和7億肥胖[1]。隨著不健康的飲食行為和久坐的生活方式的日益普遍,肥胖已成為非胰島素依賴性糖尿病、高血壓、心血管疾病、癌癥以及相關(guān)代謝和生殖的重要危險(xiǎn)因素。肥胖對(duì)女性生育的影響眾所周知,包括月經(jīng)失調(diào)、無排卵、多囊卵巢綜合征、流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)增加和受孕率降低[2]。有證據(jù)表明,肥胖同樣損害男性生育能力[3],表現(xiàn)為精液質(zhì)量差,勃起功能障礙或性激素紊亂[4]。肥胖患者脂肪細(xì)胞的大小增加,使促炎性因子分泌增加[5],并減少胰島素敏感性相關(guān)的脂肪因子—脂聯(lián)素的分泌。推測脂肪細(xì)胞肥大可能因?yàn)槲h(huán)境改變導(dǎo)致下丘腦的炎癥反應(yīng),抑制了下丘腦Kisspeptin/GnRH/Kiss1信號(hào)軸的作用,從而使下丘腦介導(dǎo)的生殖調(diào)節(jié)紊亂[6]。

垂直束帶式胃減容術(shù)是病態(tài)肥胖最常用的手術(shù)治療方法,但如果飲食習(xí)慣沒有改變,高脂肪飲食(HFD)有關(guān)的生育功能受損仍將繼續(xù)存在。本研究通過創(chuàng)建HFD誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型,評(píng)估垂直束帶式胃減容術(shù)對(duì)造模雄鼠生育力的影響。垂直束帶式胃減容術(shù)可能通過抑制睪丸和下丘腦對(duì)HFD的代謝異常反應(yīng),從而逆轉(zhuǎn)HFD所致的生殖功能損傷。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

8周齡雄性SD大鼠購自SLAC上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,并分別置于通風(fēng)籠中,恒溫24～26 ℃的溫度和濕度,以及12 h光照/12 h黑暗周期。大鼠可飲用自來水,喂食60%HFD(Research Diets,SLAC試驗(yàn)動(dòng)物有限公司),持續(xù)16周以誘導(dǎo)肥胖。對(duì)照大鼠喂食對(duì)照飲食(CD)。所有動(dòng)物均按照國立衛(wèi)生研究院關(guān)于和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指南進(jìn)行治療。動(dòng)物試驗(yàn)獲同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院試驗(yàn)動(dòng)物許可證,經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并備案。

1.2 手術(shù)造模

16周齡雄鼠,根據(jù)lee’s指數(shù)篩選出肥胖大鼠作為肥胖組。分為假手術(shù)對(duì)照HFD組和HFD + SG組,每組15只。手術(shù)由減肥外科醫(yī)師進(jìn)行[7]。步驟如下:術(shù)前禁食24 h,4%七氟烷麻醉,切開從胃竇到胃底和腺胃的前胃大彎,大約90%前胃和70%的胃腺,然后用聚二氧雜環(huán)己酮縫合線封閉切口,0.5 mL 0.25%布比卡因減少術(shù)后疼痛,術(shù)前、術(shù)后立即給予生理鹽水支持治療,必要時(shí)予丁丙諾啡0.5 mg/kg止痛,術(shù)后24 h觀察傷口吻合情況,常規(guī)流質(zhì)飲食3 d,然后再恢復(fù)HFD喂養(yǎng)8周。每周稱重,見圖1。

1.3 性激素測定

在24周測定性激素。 用免疫分析試劑盒檢測睪酮、雌二醇(E2)、促黃體生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)。

1.4 精子功能評(píng)估

將附睪與小鼠睪丸和附睪尾分開,解剖并置于預(yù)熱至37 ℃的Tyrode’s緩沖液使精子分散。15 min后,用計(jì)算機(jī)輔助精子分析、測定精子活力、運(yùn)動(dòng)性和精子密度。 對(duì)于畸形精子癥分析,將精子沉淀在載玻片上,干燥后,固定載玻片,按照試劑盒說明書操作,通過Diff-Quick染色,光學(xué)顯微鏡觀察精子畸形情況。每個(gè)樣本分析200個(gè)精子。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 5.0軟件,用t檢驗(yàn)來評(píng)估組間差異,P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 垂直束帶式胃減容術(shù)使HFD大鼠體質(zhì)量下降,血糖增加,胰島素抵抗增加

給雄性SD大鼠喂CD或HFD 16周。然后將HFD大鼠分為接受垂直束帶式胃減容術(shù)或假手術(shù)的亞組,然后再恢復(fù)飼喂8周(圖1)。HFD 16周的大鼠體質(zhì)量顯著高于CD組,(812.6±22.15)g對(duì)(498.8±22.73)g (P<0.001)。垂直束帶式胃減容術(shù)后8周,HFD大鼠的體質(zhì)量顯著低于假手術(shù)的HFD組大鼠,但仍顯著高于CD組大鼠(圖2)。

圖1成功造模肥胖不育SD雄性大鼠(左側(cè)為造模鼠,右側(cè)為正常鼠)

Fig.1Successfulestablishmentofobesity-inducedmaleinfertilityinSDratsmodel(left:modelrat,right:normalrat)

2.2 垂直束帶式胃減容術(shù)改善性激素水平和精子功能

從附睪尾部提取的精子分析顯示,活力和前向運(yùn)動(dòng)(圖3)均顯著低于CD組。結(jié)果提示,垂直束帶式胃減容術(shù)可以逆轉(zhuǎn)精子功能。組間的精子濃度沒有顯著差異(圖3)。 HFD組的精子畸形率高于CD和HFD+SG組,CD和HFD+SG組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。以上結(jié)果說明,垂直束帶式胃減容術(shù)改善了精子質(zhì)量并提高了生殖能力。

圖2對(duì)高脂鼠進(jìn)行垂直束帶式胃減容術(shù)(A),其體質(zhì)量明顯下降(B)

CD為正常對(duì)照組,HFD為高脂造模組,HFD+SG為接受手術(shù)減重組

Fig.2Theeffectsofsleevegastrectomy(A)ontheweightofrats(B)

CD:thechowdietratgroup;HFD:thehigh-fatdietratgroup;HFD+SG:thehigh-fatdietratgroupwithsleevegastrectomy

HFD大鼠的血清雌二醇[(8.08±0.22) pg/mL]顯著高于CD組[(4.44±0.42) pg/mL,P<0.001]。手術(shù)使肥胖大鼠雌二醇水平下降,與CD組相比差異無顯著性,血清睪酮顯著高于CD組[(1.19±0.15) ng/mL比(2.38±0.61) ng/mL,P<0.001],LH亦明顯高于CD組[(0.64±0.11) ng/mL比(0.96±0.23) ng/mL,P<0.05]。術(shù)后,睪酮和LH水平與CD組無顯著差異。 FSH水平在三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

3 討論

肥胖已成為一種全球性的流行病,并且是包括男性不育癥在內(nèi)的不良健康結(jié)果的原因[8-9]。報(bào)道認(rèn)為,肥胖對(duì)精液和血清性激素水平有一定影響[10],但肥胖導(dǎo)致男性生育功能損傷的原因尚不清楚。本研究通過對(duì)16周HFD誘導(dǎo)的雄性大鼠肥胖模型,研究肥胖型男性生殖功能障礙的發(fā)病機(jī)制。進(jìn)一步通過垂直束帶式胃減容術(shù)和額外的8周喂食HFD,研究肥胖的影響。垂直束帶式胃減容術(shù)大鼠,與假手術(shù)組相比,體質(zhì)量明顯下降,血脂水平顯著改善。

內(nèi)分泌失調(diào)是肥胖的另一個(gè)典型特征,伴隨著脂肪組織積聚,血清總睪酮,游離睪酮,LH,FSH水平下降,雌二醇(E2)水平升高,與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[11]。雌激素的增加引起GnRH降低,抑制LH和FSH分泌,并降低睪酮分泌和精子形成[12]。本研究發(fā)現(xiàn),垂直束帶式胃減容術(shù)不僅減輕了HFD大鼠的體質(zhì)量,同時(shí)降低了E2的表達(dá),精子的特征變化證實(shí)了肥胖與男性生育力之間的關(guān)系。垂直束帶式胃減容術(shù)可逆轉(zhuǎn)肥胖相關(guān)的精子活力下降和前向運(yùn)動(dòng)。 CD,HFD和HFD+SG三組間精子濃度沒有差異,這與之前在人類[13]和小鼠中的研究一致。垂直束帶式胃減容術(shù)逆轉(zhuǎn)了肥胖相關(guān)的畸精癥的發(fā)生率,表明炎癥反應(yīng)在男性不育中起重要作用。在該模型中,肥胖導(dǎo)致睪丸炎癥反應(yīng),包括巨噬細(xì)胞浸潤增加和炎性因子表達(dá),認(rèn)為肥胖通過刺激巨噬細(xì)胞募集和活化促進(jìn)睪丸炎癥,最終導(dǎo)致精子質(zhì)量下降和精子生育能力受限。

下丘腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)是生殖功能的調(diào)節(jié)中樞,通過下丘腦-腦垂體-性腺(HPG)軸實(shí)現(xiàn)。男性生殖功能的調(diào)節(jié)是由下丘腦分泌的GnRH刺激腦垂體分泌促性腺激素,在后者的作用下,睪丸分泌雄性激素和產(chǎn)生精子。Kisspeptin是GnRH神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑[14],Kisspeptin在前腦的弓狀核和前腹側(cè)室旁核(AVPV)中大量表達(dá)。雌二醇和睪酮調(diào)節(jié)弓形核和AVPV中的Kiss1基因表達(dá)。然而,雌二醇和睪酮下調(diào)弓形核中的Kiss1 mRNA表達(dá),卻在AVPV中上調(diào)其表達(dá)。弓狀核中的Kisspeptin神經(jīng)元可能參與負(fù)反饋調(diào)節(jié)的促性腺激素分泌。Kiss1和GPR54 mRNA在青春期時(shí)顯著增加,表明kisspeptin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為青春期發(fā)作的神經(jīng)內(nèi)分泌事件。kissl在調(diào)節(jié)青春期和生育能力方面發(fā)揮作用,kissl失活降低了生育力,并且與小鼠中的不育表型相關(guān)。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),肥胖引起的生殖障礙也可能與下丘腦損傷有關(guān)。在本研究的HFD模型中,STAT3激活促進(jìn)肥胖大鼠中的M2小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化,其介導(dǎo)下丘腦的神經(jīng)炎癥反應(yīng),抑制了Kiss1的表達(dá)。故認(rèn)為,肥胖通過促進(jìn)M2小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化在下丘腦中產(chǎn)生炎癥,最終導(dǎo)致抑制Kiss1表達(dá)和生殖障礙的炎癥反應(yīng),垂直束帶式胃減容則逆轉(zhuǎn)此結(jié)局。

圖3 對(duì)高脂鼠進(jìn)行垂直束帶式胃減容術(shù)后,生殖功能明顯改善,雄激素水平升高(左圖),精子活力增加(右圖)

圖4高脂飲食型肥胖對(duì)生殖內(nèi)分泌激素存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,升高E2(A),降低LH(B),FSH無明顯作用(C)

Fig.4Thecomplexeffectsofhigh-fatdietinducedobesityonreproductiveendocrinehormones,includingincreasingE2(A),decreasingLH(B),andnoeffectonFSH(C)

HFD誘導(dǎo)的肥胖導(dǎo)致生殖力受損,垂直束帶式胃減容術(shù)不僅可以減肥,并且逆轉(zhuǎn)肥胖引起的生殖障礙,從而為臨床肥胖型男性生殖疾病的臨床治療提供新的思路。