劉 穎，張 軍，戴金穎，王順意，戴金宇

(1. 河北省唐山市中醫(yī)醫(yī)院，河北 唐山 063000；2. 河北省唐山市豐潤(rùn)區(qū)人民醫(yī)院，河北 唐山 064000)

近年來研究顯示，肥胖尤其是腹型肥胖，是2型糖尿病的重要危險(xiǎn)因素之一，是胰島素抵抗的主要誘因[1]。脂肪組織作為胰島素抵抗主要靶組織之一，不僅通過脂肪細(xì)胞本身的肥大增生及炎癥反應(yīng)的發(fā)生，參與調(diào)節(jié)胰島素抵抗的進(jìn)展，更可分泌瘦素、脂聯(lián)素等一系列脂肪細(xì)胞因子，干預(yù)胰島素信號(hào)系統(tǒng)的生理負(fù)反饋調(diào)節(jié)，直接誘導(dǎo)胰島素抵抗的產(chǎn)生并調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)水平[2]。益氣養(yǎng)陰活血方為臨床治療2型糖尿病胰島素抵抗患者的經(jīng)驗(yàn)方劑，尤其對(duì)氣陰兩虛兼瘀型效果顯著。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)2型糖尿病大鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下脂肪組織形態(tài)及血清瘦素、脂聯(lián)素的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 動(dòng)物與飼料 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠60只，約12周齡，體質(zhì)量220～250 g，購自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(軍)2014-0001?；A(chǔ)飼料(B級(jí))由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0010；高脂飼料(A級(jí))由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0008。

1.2 藥物 益氣養(yǎng)陰活血方：黃芪15 g，太子參15 g，熟地15 g，鬼箭羽15 g，山萸肉15 g，黃精15 g，葛根10 g，當(dāng)歸10 g，丹皮10 g，丹參30 g，三七粉2 g(此均為成人一日用藥量)。以上中藥材均購自中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，為產(chǎn)自廣東一方制藥的顆粒劑，根據(jù)公式(低劑量=每天正常人給藥劑量÷人的體質(zhì)量×6.25)計(jì)算大鼠給藥量，并按照1∶2∶4比例選擇低、中、高劑量，即13.75 g/kg、27.5 g/kg、55 g/kg。津力達(dá)顆粒：石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字 Z20050845)，換算成大鼠的給藥量為1.5 g/kg。應(yīng)用時(shí)將上述顆粒劑溶于適量水中制成混懸液。

1.3 試劑和儀器 鏈脲佐菌素(STZ)由美國(guó)Cayman公司生產(chǎn)，大鼠瘦素(脂聯(lián)素)ELISA檢測(cè)試劑盒購自北京凱諾春天生物科技有限公司，甲醛溶液購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司。血糖儀及配套試紙(美國(guó)拜耳醫(yī)藥保健有限公司)，組織包埋機(jī)(TB-718E，湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司)，石蠟切片機(jī)(RM2245，德國(guó)LEICA公司)，烘片機(jī)(HI1220，德國(guó)LEICA公司)，生物顯微鏡(BX53，日本Olympus公司)，顯微鏡數(shù)碼相機(jī)(DP80，日本Olympus公司)，多功能酶標(biāo)儀(Infinite 200 PRO，瑞士帝肯有限責(zé)任公司)，全自動(dòng)生化分析儀(Cobas-8000，德國(guó)羅氏制藥有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 60只健康雄性SD大鼠經(jīng)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)擇取10只作為正常組，其余大鼠以高脂飲食飼養(yǎng)加小劑量STZ腹腔注射的方法建立2型糖尿病胰島素抵抗大鼠模型：大鼠以高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周，第5周開始禁食12 h后予一次性腹腔注射1%STZ溶液(STZ溶于0.1 mol/L pH 4.2檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液中)30 mg/kg，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)72 h，然后禁食12 h，大鼠尾尖采血檢測(cè)空腹血糖(FPG)，以FPG≥11.1 mmol/L并穩(wěn)定1周為成模標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)未達(dá)標(biāo)大鼠1周后等量重復(fù)給藥，成模標(biāo)準(zhǔn)同前，成模率為97%。將成模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組10只、益氣養(yǎng)陰活血方高劑量組10只、益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組9只、益氣養(yǎng)陰活血方低劑量組10只和津力達(dá)組9只。益氣養(yǎng)陰活血方低、中、高劑量組及津力達(dá)組以高脂飼料喂養(yǎng)，并分別予益氣養(yǎng)陰活血方13.75 g/kg、27.5 g/kg、55 g/kg和津力達(dá)1.5 g/kg灌胃；正常組和模型組分別喂以普通飼料和高脂飼料，并以等量的生理鹽水灌胃。各組每天同一時(shí)間灌胃1次，連續(xù)4周。

1.5 標(biāo)本采集和指標(biāo)檢測(cè) ①末次灌胃后，禁食12 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，試管靜置20 min，在4 ℃下3 000 r/min離心15 min，取上清液，-20 ℃保存。采用ELISA法測(cè)定脂聯(lián)素、瘦素、胰島素(FINS)水平，采用生化法檢測(cè)FPG水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、胰島素敏感指數(shù)(ISI，ISI呈非正態(tài)分布，故多采用其自然對(duì)數(shù)IAI進(jìn)行統(tǒng)計(jì))， HOMA-IR=FPG×FINS /22.5，ISI=1/FPG×FINS ，IAI=LnISI。②取大鼠腎周脂肪組織，于10%福爾馬林溶液中充分固定24 h以上后，制作病理切片并進(jìn)行HE染色。于200倍光鏡下觀察脂肪組織形態(tài)；于400倍光鏡下觀察脂肪細(xì)胞大小，并采用image-J軟件測(cè)量脂肪細(xì)胞面積，計(jì)算脂肪細(xì)胞相對(duì)面積。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠HOMA-IR、IAI比較 模型組大鼠HOMA-IR明顯高于正常組(P<0.05)，IAI明顯低于正常組(P<0.05)；益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組和津力達(dá)組HOMA-IR均明顯低于模型組(P均<0.05)，IAI均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠HOMA-IR、IAI比較±s)

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.2 各組大鼠血清脂聯(lián)素、瘦素比較 模型組大鼠脂聯(lián)素水平明顯低于正常組(P<0.05)，瘦素水平明顯高于正常組(P<0.05)；益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組及津力達(dá)組大鼠脂聯(lián)素水平均明顯高于模型組(P均<0.05)，瘦素水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清脂聯(lián)素、瘦素水平比較±s，ng/mL)

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.3 各組大鼠脂肪組織形態(tài)學(xué)比較 200倍光鏡下，正常組脂肪細(xì)胞體積較小，大小均等，細(xì)胞膜邊界清晰，間質(zhì)內(nèi)較少炎細(xì)胞浸潤(rùn)和毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，見圖1；模型組脂肪細(xì)胞體積較大，大小不等，細(xì)胞膜邊界不清晰，細(xì)胞相交處有部分融合，有合成大細(xì)胞的傾向，間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)和毛細(xì)血管擴(kuò)張充血明顯增多，見圖2；益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組及津力達(dá)組脂肪細(xì)胞體積中等，間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)和毛細(xì)血管擴(kuò)張充血較模型組有所好轉(zhuǎn)，見圖3～6。400倍光鏡下，各組脂肪細(xì)胞大小見圖7～12，其中正常組大鼠脂肪細(xì)胞相對(duì)面積為1.00±0.21，模型組為6.18±0.49，益氣養(yǎng)陰活血方低劑量組為3.21±0.28，益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組為2.60±0.31，益氣養(yǎng)陰活血方高劑量組為2.90±0.34，津力達(dá)組為2.77±0.37。模型組脂肪細(xì)胞相對(duì)面積明顯較正常組增大約6倍(P<0.05)，益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組及津力達(dá)組脂肪細(xì)胞相對(duì)面積均明顯低于模型組(P均<0.05)。

圖1 正常組脂肪組織鏡下表現(xiàn)(HE，×200)

圖2 模型組脂肪組織鏡下表現(xiàn)(HE，×200)

圖3 益氣養(yǎng)陰活血方低劑量組脂肪組織鏡下表現(xiàn)(HE，×200)

3 討 論

胰島素抵抗是指胰島素靶組織對(duì)胰島素的反應(yīng)性和敏感性下降，導(dǎo)致機(jī)體糖脂代謝紊亂、體質(zhì)量增加。胰島素可通過刺激其靶組織對(duì)葡萄糖的攝取，調(diào)節(jié)碳水化合物的分解和糖異生，以供給機(jī)體正常生理所需能量，其機(jī)制與中醫(yī)脾主運(yùn)化的功能類似，而素體稟賦不足、飲食失節(jié)等均可致脾失健運(yùn)，氣血津液生化失源，致氣陰兩虛，氣為血之帥，氣虛則血行無力，津血同源，陰津不足則血凝煉，瘀血內(nèi)生，故終呈氣陰兩虛兼瘀的虛實(shí)夾雜之證，臨床中2型糖尿病胰島素抵抗患者多為此型。益氣養(yǎng)陰活血方即針對(duì)此證型而設(shè)，方中太子參、黃芪為君，補(bǔ)氣健脾，使氣旺以助血行，祛瘀不傷正；黃精、山萸肉、熟地、葛根為臣，益氣養(yǎng)陰，補(bǔ)血生津，使氣陰雙補(bǔ)，扶助本虛之正氣；當(dāng)歸、丹參、丹皮、三七粉、鬼箭羽為佐，涼血補(bǔ)血活血，兼去標(biāo)實(shí)之邪氣，使瘀去而氣血流通，津液精微得以正常輸布。諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰、活血化瘀之功?，F(xiàn)代藥理研究也表明，方中太子參、黃芪、葛根、鬼箭羽等所含的多種有效成分，均能通過介導(dǎo)胰島素信號(hào)的傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)瘦素、脂聯(lián)素等細(xì)胞因子表達(dá)，或直接作用于胰島β細(xì)胞，調(diào)節(jié)糖脂代謝，增加胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[3-4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠ISI降低，HOMA-IR升高，大鼠呈現(xiàn)明顯的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，經(jīng)益氣養(yǎng)陰活血方干預(yù)后，各組大鼠ISI升高，HOMA-IR降低，證實(shí)益氣養(yǎng)陰活血方確能明顯提高機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，改善大鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

圖4 益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組脂肪組織鏡下表現(xiàn)(HE，×200)

圖5 益氣養(yǎng)陰活血方高劑量組脂肪組織鏡下表現(xiàn)(HE，×200)

圖6 津力達(dá)組脂肪組織鏡下表現(xiàn)(HE，×200)

圖7 正常組脂肪細(xì)胞大小(HE，×400)

圖8 模型組脂肪細(xì)胞大小(HE，×400)

圖9 益氣養(yǎng)陰活血方低劑量組脂肪細(xì)胞大小(HE，×400)

圖10 益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組脂肪細(xì)胞大小(HE，×400)

圖11 益氣養(yǎng)陰活血方高劑量組脂肪細(xì)胞大小(HE，×400)

圖12 津力達(dá)組脂肪細(xì)胞大小(HE，×400)

脂肪組織是胰島素的主要效應(yīng)組織之一，具有活躍的內(nèi)分泌功能，可分泌脂聯(lián)素、瘦素等多種細(xì)胞因子，參與機(jī)體代謝，雙向調(diào)節(jié)胰島素抵抗。脂聯(lián)素是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種和機(jī)體脂質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)的細(xì)胞因子，是脂肪組織與機(jī)體代謝的紐帶，可通過刺激脂肪代謝并抑制其合成，同時(shí)促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，達(dá)到改善糖脂代謝紊亂、抗炎和增加胰島素敏感性的作用[5-6]。而脂肪組織的肥大會(huì)導(dǎo)致機(jī)體脂聯(lián)素基因表達(dá)和血清水平顯著降低，抑制周圍組織對(duì)葡萄糖的攝取和對(duì)炎癥的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而增加胰島素抵抗發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。瘦素也是評(píng)估胰島素抵抗的重要指標(biāo)[9]，生理狀態(tài)下，瘦素可作用于下丘腦食欲中樞，抑制神經(jīng)肽Y，并激活對(duì)ATP敏感的鉀離子通路，干預(yù)胰島素分泌，調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性[10]，防止高胰島素血癥和胰島素抵抗的發(fā)生。但肥胖者因其自身下丘腦上瘦素受體對(duì)瘦素的敏感性下降，瘦素反應(yīng)性分泌增加，產(chǎn)生瘦素抵抗，使瘦素對(duì)胰島素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制受到破壞，進(jìn)而誘發(fā)胰島素抵抗[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠脂聯(lián)素水平明顯降低，瘦素水平明顯升高，與機(jī)體的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)相符，并提示大鼠產(chǎn)生了瘦素抵抗，經(jīng)益氣養(yǎng)陰活血方干預(yù)后，各組大鼠脂聯(lián)素水平明顯升高，瘦素水平明顯降低，表明益氣養(yǎng)陰活血方或可通過增加脂聯(lián)素分泌，緩解瘦素抵抗，調(diào)節(jié)機(jī)體的能量代謝，改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

脂肪組織也是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的主要內(nèi)分泌器官，當(dāng)機(jī)體能量攝入過多時(shí)，大量脂質(zhì)過度沉積在脂肪組織中，超過脂肪的儲(chǔ)存能力，則可導(dǎo)致脂肪組織擴(kuò)張，即脂肪細(xì)胞面積增大和數(shù)目增多，肥大的脂肪細(xì)胞表面胰島素受體減少，對(duì)胰島素親和力下降，可誘發(fā)胰島素抵抗，同時(shí)伴隨脂肪細(xì)胞的肥大增生，氧分壓降低，脂肪組織處于相對(duì)缺氧的狀態(tài)，其正常的生理功能受到抑制，腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等炎癥因子大量分泌，抑制了脂肪組織正常的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，致使脂肪組織合成能力降低，靶組織對(duì)葡萄糖的攝取及對(duì)胰島素的敏感性降低，引發(fā)胰島素抵抗，因此不少學(xué)者將脂肪細(xì)胞的肥大看作胰島素抵抗的獨(dú)立標(biāo)志[12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠脂肪細(xì)胞體積明顯增大，間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多，說明隨大鼠胰島素抵抗的發(fā)生，其脂肪細(xì)胞也表現(xiàn)出了典型的肥大特征及炎癥反應(yīng)狀態(tài)，經(jīng)益氣養(yǎng)陰活血方干預(yù)后，各組大鼠脂肪細(xì)胞體積及間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，說明益氣養(yǎng)陰活血方可明顯改善胰島素抵抗大鼠脂肪細(xì)胞的肥大和炎癥反應(yīng)，緩解大鼠脂肪組織的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

綜上所述，脂肪組織及其分泌的脂肪細(xì)胞因子與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，而益氣養(yǎng)陰活血方能有效改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，其作用的發(fā)揮可能與其改善脂肪細(xì)胞肥大和炎癥反應(yīng)，并正向調(diào)節(jié)血清中瘦素、脂聯(lián)素水平有關(guān)，這也提示，以脂肪組織為靶點(diǎn)，檢測(cè)并改善患者瘦素、脂聯(lián)素水平，或可成為診治2型糖尿病胰島素抵抗的新思路。