郭曉東

(遼寧省沈陽市第九人民醫(yī)院，遼寧 沈陽 110024)

骨質(zhì)疏松癥是骨組織顯微結(jié)構(gòu)改變的一種全身性骨骼疾病，由于骨量減少，骨脆性增加，患者常伴有腰背疼痛、身長縮短，易發(fā)骨折，甚則引發(fā)呼吸功能下降，嚴重影響人們的生活質(zhì)量[1-2]。由于女性絕經(jīng)后卵巢功能減退，體內(nèi)雌激素水平下降，從而打破骨生成和骨吸收之間的平衡，所以該病尤易發(fā)生于絕經(jīng)后婦女[3]。所以，對激素型骨質(zhì)疏松癥的防治研究已經(jīng)引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注。中醫(yī)認為腎主骨生髓，腎虛是骨質(zhì)疏松癥的根本病因[4]。菟絲子是一年生的雙子葉草本植物，具有補腎益精作用，菟絲子黃酮是其主要活性成分，具有雌激素樣活性[5]。本實驗采用經(jīng)典雙側(cè)切除大鼠卵巢法[6]制備骨質(zhì)疏松模型，通過觀察菟絲子黃酮對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥骨物理生長、骨密度、血清生化及骨保護蛋白等相關(guān)指標的影響，探討其骨保護作用及機制，為其臨床用于骨質(zhì)疏松癥的防治提供理論依據(jù)。

1 實驗資料

1.1 動物及藥物 SPF級SD雌性大鼠40只，體質(zhì)量(230±10)g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK(遼)2015-0001；菟絲子黃酮粉購自上海源葉生物科技有限公司；己烯雌酚購自廣東彼迪藥業(yè)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器 血清鈣(Ca)、磷(P)及堿性磷酸酶(ALP)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。骨保護蛋白(OPG)及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax多克隆抗體購于美國Santa公司。TriStar2 LB 942型多功能酶標儀(伯托公司，德國)，電子天平(賽多利斯，德國)，雙 能 X 射線 骨 密度儀( HOLOGIC 公司，美國)，SHZ-88型水浴恒溫振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，BX51-WIF型Stratos型臺式多功能冷凍高速離心機(賽默飛世爾有限公司，德國)，Trans-Blot SD型半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad，美國)，F(xiàn)3型全自動熒光與可見光凝膠成像分析系統(tǒng)(Syngene，英國)。

1.3 分組、造模及干預(yù) 將40只SD雌性大鼠隨機分成假手術(shù)組、模型組、中藥組和西藥組，每組10只。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，除假手術(shù)組外，其余組大鼠均行腹側(cè)入路雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)建立骨質(zhì)疏松模型，假手術(shù)組大鼠僅切除卵巢周圍少量脂肪組織。縫合切口，外敷消炎粉。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，每日消毒，4周后，中藥組大鼠每天給予菟絲子黃酮0.1 g/kg灌胃，西藥組大鼠每天給予己烯雌酚30 μg/kg灌胃，假手術(shù)組及模型組大鼠每天給予等體積生理鹽水灌胃，灌胃時間均為12周。

1.4 相關(guān)指標檢測

1.4.1 腰椎骨密度 于手術(shù)前和灌胃12周后，采用雙能X射線骨密度儀對大鼠進行腰椎骨質(zhì)平掃，采集4個部位，并取平均值。

1.4.2 血清Ca、P及ALP水平 各組大鼠麻醉后腹主動脈取血，分離血清，-20 ℃保存，嚴格按照試劑盒說明書測定血清Ca、P及ALP水平。

1.4.3 骨物理生長指標 完整取出大鼠左右兩側(cè)股骨，剔凈附著的軟組織和軟骨。左側(cè)股骨60 ℃恒溫烘烤至恒重后用電子天平稱質(zhì)量并測量骨物理生長指標。

1.4.4 股骨OPG、Bcl-2、Bax蛋白表達水平 取右側(cè)股骨，骨組織以液氮冷凍后鋼錘砸碎加入超聲裂解細胞，超聲裂解后12 000 r/min離心40 min，取上清蛋白溶液，蛋白定量后，以50 μg蛋白/泳道上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入1∶500兔抗人OPG、Bcl-2、Bax一抗，4 ℃封閉過夜，TBST洗滌3次，每次10 min。加入HRP標記的羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌4次，每次10 min。按試劑盒說明書混合適量發(fā)光液A和B避光保存，將膜放在曝光板上，膜上滴適量的發(fā)光液，應(yīng)用全自動熒光與可見光凝膠成像分析系統(tǒng)曝光分析圖片。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清Ca、P及ALP水平比較 模型組大鼠血清Ca水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；西藥組血清Ca水平明顯低于模型組(P<0.05) ，中藥組血清Ca、ALP水平均明顯高于模型組及西藥組(P均<0.05) 。見表1。

表1 各組大鼠血清Ca、P及ALP水平比較±s)

注：①與假手術(shù)組比較,P<0.05；②與模型組比較,P<0.05；③與中藥組比較,P<0.05。

2.2 各組大鼠骨物理生長指標比較 模型組大鼠骨質(zhì)量指數(shù)明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)；中藥組與西藥組大鼠骨質(zhì)量指數(shù)均明顯高于模型組(P均<0.05)，已接近正常水平；各組大鼠股骨的長度和寬度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠骨物理生長指標±s)

注：①與假手術(shù)組比較,P<0.05；②與模型組比較,P<0.05。

2.3 各組大鼠腰椎骨密度比較 術(shù)前，4組大鼠腰椎骨密度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；灌胃12周后，模型組、中藥組和西藥組大鼠腰椎骨密度均明顯低于術(shù)前(P均<0.05)，且模型組大鼠腰椎骨密度明顯低于假手術(shù)組、中藥組與西藥組(P均<0.05)，中藥組與西藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腰椎骨密度比較±s，g/cm2)

注：①與術(shù)前比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.4 各組大鼠股骨OPG、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較 模型組大鼠股骨中Bax蛋白表達水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，而Bcl-2、OPG蛋白表達水平明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)；中藥組與西藥組大鼠股骨中Bax蛋白表達水平明顯低于模型組(P均<0.05)，而Bcl-2、OPG蛋白表達水平明顯高于模型組(P均<0.05)；中藥組與西藥組各指標比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠股骨OPG、Bcl-2、Bax蛋白表達水平

3 討 論

有調(diào)查研究表明，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率隨著年齡的增長而升高，絕經(jīng)后的女性機體內(nèi)雌激素分泌水平急速下降，尤易誘發(fā)骨代謝紊亂而發(fā)為此病，我國目前已有2.1億人骨量低于正常標準[7-8]。臨床上常采用雌激素療法防治骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展，但長期單純補充雌激素會增加子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等其他疾病發(fā)生的風(fēng)險，如何防治骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展已成為廣大醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點。

中醫(yī)認為，腎虛是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的根本病機，腎虛不能生精化髓，骨骼失于濡養(yǎng)，脆弱無力而發(fā)為本病[9]，故治宜補腎生精。菟絲子為補腎方中常用的君藥，其有效成分菟絲子黃酮可以顯著升高大鼠血清中雌激素水平，同時還具有抗凋亡、抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用[5，10]。我國菟絲子資源豐富,所以開發(fā)利用菟絲子黃酮來防治骨質(zhì)疏松癥具有很好的發(fā)展前景。

骨物理生長指標、骨密度及血清Ca、P、ALP水平是評價藥物治療激素型骨質(zhì)疏松癥效果的重要指標[11-12]。本實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清Ca水平明顯升高，P、ALP水平無明顯變化，骨質(zhì)量指數(shù)和腰椎骨密度顯著降低,說明骨質(zhì)疏松癥模型復(fù)制成功；與模型組比較，中藥組大鼠骨質(zhì)量指數(shù)、腰椎骨密度及血清ALP水平均明顯升高，但 Ca、P水平變化不明顯，說明菟絲子黃銅對大鼠激素型骨質(zhì)疏松癥具有明顯骨保護作用，但其對抑制骨吸收效果不顯著，可能主要是通過促進成骨細胞功能活動從而增加骨的形成發(fā)揮作用。

細胞凋亡是由基因控制的細胞有序的自主死亡，但并不是在病理條件下的自體損傷，而是為了更好地適應(yīng)生存環(huán)境去主動死亡的過程，涉及一系列基因激活、表達以及調(diào)控等的作用。有研究表明，成骨細胞凋亡在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著非常重要的作用[13-14]。為了進一步探討菟絲子黃酮治療骨質(zhì)疏松癥的機制，本實驗選取與成骨細胞凋亡密切相關(guān)的Bcl-2、Bax[15]和具有判斷“絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥理想指標”之稱的OPG蛋白[16]作為研究靶點。Bcl-2屬于抗凋亡成員，Bax則屬于促凋亡成員，兩者是一對負反饋調(diào)節(jié)因子[17]。OPG是一種分泌型蛋白，屬于破骨細胞的負性調(diào)節(jié)因子，可以有效誘導(dǎo)破骨細胞凋亡，增加骨密度[18]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠股骨中Bax蛋白表達水平明顯高于假手術(shù)組，Bcl-2及OPG蛋白表達水平明顯低于假手術(shù)組；中藥組與西藥組大鼠股骨中Bax蛋白表達水平明顯低于模型組，Bcl-2及OPG蛋白表達水平明顯高于模型組。提示菟絲子黃酮可通過抑制成骨細胞凋亡發(fā)揮對骨組織的保護作用。

綜上所述，菟絲子黃酮對大鼠激素型骨質(zhì)疏松癥具有很好的骨保護作用，并在分子水平上為菟絲子黃酮用于骨質(zhì)疏松癥尤其是激素型骨質(zhì)疏松癥的防治提供了有力的理論依據(jù),也為后續(xù)深入探討其作用機制提供了基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。