徐齊君，扎 桑，王玉林，原紅軍，曾興權，尼瑪扎西

(1. 西藏自治區(qū)農牧科學院農業(yè)研究所,西藏 拉薩 850002; 2. 省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室,西藏 拉薩 850002; 3. 西藏自治區(qū)農牧科學院,西藏 拉薩 850002)

【研究意義】青稞(HordeumvulgareL. var. nudum HK.f.)為禾本科大麥屬，又名裸大麥、米大麥，為藏族人民主要糧食作物。青稞主要生長在海拔高、溫度低、日照長、晝夜溫差大的地區(qū)，對環(huán)境的抗逆性較強[1]。近些年來，研究者們先后對青稞的抗鹽性[2-3]、抗旱性[4-5]等方面進行了研究，以期明確青稞的抗逆機制，篩選出有應用價值的基因，為提高青稞的產量和質量，選育出抗逆性強的優(yōu)良品種提供理論依據?！颈狙芯壳腥朦c】在前期研究中，采用轉錄組測序和抑制性差減雜交技術對青稞的抗寒相關基因進行了篩選，其中，核糖體蛋白基因RPL19(GeneBank登錄號: AK361587)位列其中[6]?！厩叭搜芯窟M展】核糖體蛋白主要有70S和80S 2種類型，70S存在于細菌、線粒體和葉綠體中，分50S和30S 2個亞基；80S核糖體存在于真核生物的細胞質中，分60S和40S 2個亞基[7]。研究表明，核糖體蛋白除組成核糖體參與蛋白質合成外，還通過參與復制、轉錄、RNA加工、DNA修復等作用于細胞的分裂、增殖、分化、發(fā)育調控等多種生命過程[8-10]?！緮M解決的關鍵問題】對得到的青稞RPL19基因的初步分析顯示，該基因編碼一個50S葉綠體核糖體蛋白。為進一步了解該基因的相關信息，以青稞為材料，進行RPL19基因的克隆、序列分析及原核表達，旨在為進一步了解RPL19的功能，明確其與青稞的抗寒相關性方面奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

青稞種質‘喜馬拉雅8號’和‘青稞320’由西藏自治區(qū)農牧科學院提供。

1.2 方法

1.2.1 青稞種苗轉錄本的提取及反轉錄 取適量的青稞種子播種于富含有機質的盆栽土壤中，正常澆水管理，待植株生長至正常大小時，采用Jena InnuPREP RNA Mini Kit提取新鮮葉片RNA，采用TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit進行反轉錄，cDNA樣本-20 ℃保存。

1.2.2HbRPL19基因的克隆 以轉錄組測序分析結果為基礎，利用Primer Premier 5.0 軟件設計特異引物RPL19-F：5′- ATTGCGGGATCCATGCAGTCTTTAGTGC -3′，RPL19-R：5′- ATCTCGCTCGAGTCAT TTCTTGAGTGCATTC -3′，下劃線分別為BamH I和XhoI酶切位點。RT-PCR反應在S-1000 Thermal Cycler進行，反應體系采用20 μl PCR擴增體積：TaqDNA聚合酶(TaKaRa，5 U/μl) 0.2 μl，10×PCR反應緩沖液(Takara) 2 μl，dNTP(10 mmol/L)1.6 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，cDNA 2 μl，滅菌水12.6 μl。反應條件：94 ℃變性4 min，94 ℃變性50 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，34循環(huán)；72 ℃延伸10 min?；厥漳繕似?，克隆、測序。

1.2.3HbRPL19基因的生物信息學分析 利用NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/)、ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)、ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)、DISPHOS(http://www.dabi.temple.edu/disphos/)、InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)、Conserved domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、Signal IP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、PredictProtein(https://ppopen.rostlab.org/)、NPS(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)等網絡資源對HbRPL19進行序列分析。根據推測的HbRPL19氨基酸序列，利用MEGA5.1軟件進行氨基酸序列同源性比對和進化樹分析。

1.2.4 原核表達載體的構建及轉化 挑選測序正確的陽性克隆提質粒，采用BamHI和XhoI分別雙酶切陽性重組質粒和表達質粒pET-28a(+)，凝膠回收目標片段，使用T4DNA連接酶與16 ℃連接過夜，挑單克隆震蕩培養(yǎng)后提質粒，酶切鑒定陽性重組質粒。將鑒定正確的陽性質粒pET28a-RPL19轉化表達宿主菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，同時將提取的空載體pET-28a(+)轉化表達宿主菌BL21(DE3)作陽性對照，BL21(DE3)感受態(tài)細胞不轉化組作陰性對照。

1.2.5 蛋白的誘導及檢測 分別挑單克隆接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基(含Kan 100 μg/mL)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5時，取1 mL按1∶100比例接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中；將培養(yǎng)的100 mL培養(yǎng)液分為2份，其中1份加IPTG誘導表達，另1份不加IPTG作為對照，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)8 h。取IPTG誘導后菌液1 mL，離心，棄上清，沉淀用生理鹽水洗滌后，加入100 μl生理鹽水及5×SDS上樣緩沖液25 μl，100 ℃煮沸10 min，離心，取上清進行SDS-PAGE。對未誘導菌液做同樣處理，觀察表達情況。同時將LB液體培養(yǎng)未轉化及空載體pET28a(+)轉化的BL21作為對照。

2 結果與分析

2.1 HbRPL19基因的克隆

以電子克隆延伸得到的序列(GeneBank登錄號: AK361587)為基礎設計特異引物，擴增青稞苗期葉片的cDNA，獲得1個條帶654 bp的cDNA序列(圖1)，測序分析顯示該片段為預期的HbRPL19基因CDS全長。

圖1 HbRPL19基因擴增結果Fig.1 Amplification of HbRPL19

2.2 HbRPL19基因的序列分析

用ORFfinder在線分析顯示，HbRPL19基因CDS全長654 bp，編碼1個217個氨基酸的多肽(圖2)。ProtParam分析表明，HbRPL19基因編碼的多肽相對分子質量為24.47 KD，理論等電點(pI)為10.42，分子式為C1082H1791N327O302S8，總平均親水性(GRAVY)為-0.353，不穩(wěn)定系數為53.46，編碼的217個氨基酸中，包括21個帶負電荷的氨基酸殘基(天冬氨酸和谷氨酸)，40個帶正電荷的氨基酸殘基(精氨酸和賴氨酸)，其余氨基酸為非極性、疏水性氨基酸和極性、中性氨基酸，表明該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。Disphos預測表明，HbRPL19存在29個磷酸化位點(包括12個絲氨酸磷酸化位點，13個蘇氨酸磷酸化位點和4個酪氨酸磷酸化位點)，其中，只有1個絲氨酸磷酸化位點有功能(第86個氨基酸)。應用InterProScan和NCBI網站的Conserved domains分析顯示，HbRPL19蛋白存在典型的SH3-like結構域和核糖體蛋白L19結構域(圖3)。

圖2 HbRPL19基因的CDS序列和推測氨基酸序列Fig.2 CDS and amino acid sequence of HbRPL19

圖3 HbRPL19蛋白的結構域分析Fig.3 Domain analysis of HbRPL19 protein

圖4 HbRPL19的系統(tǒng)進化分析Fig.4 Systematic evolutionary analysis of HbRPL19

TMHMM預測該蛋白不含跨膜轉移功能區(qū)。Signal IP3.0 預測該蛋白沒有信號肽，不屬于分泌蛋白。PredictProtein亞細胞定位證實該基因所編碼蛋白位于葉綠體內。

Blastn分析發(fā)現，HbRPL19基因序列與山羊草、二穗短柄草、小米和高粱等植物的RPL基因全長cDNA序列相似度分別為94 %、87 %、85 %和84 %，推導的氨基酸序列同源比對分析結果表明，該基因與小麥、山羊草、二穗短柄草、水稻、小米等植物相似度分別為94 %、93 %、82 %、74 %、72 %。基于氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹表明，青稞HbRPL19蛋白(GeneBank登錄號：BAJ87120)與小麥和山羊草具有較近的親緣關系(圖4)。

NPS二級結構預測結果顯示，72個氨基酸屬于α螺旋，占33.18 %；50個氨基酸為延伸鏈，占23.04 %；19個氨基酸屬于β折疊，占8.76 %；76個氨基酸屬于無規(guī)則卷曲，占35.02 %。應用SWISS-MODEL建立該蛋白的三級結構，如圖5 所示。

2.3 HbRPL19基因的原核表達

利用BamH I和XhoI雙酶切重組質粒，結果切出的片段與預期大小相同(圖6a)，進一步的測序分析顯示，HbRPL19插入片段完全正確，未發(fā)生任何堿基突變。將重組質粒導入BL21(DE3)后，經IPTG誘導8 h后收集菌體進行SDS-PAGE分析，結果顯示融合蛋白誘導成功，與預期大小(24.47 KD)相近，融合蛋白主要存在于菌體沉淀中，上清中含量極少(圖6b)，表明得到的HbRPL19誘導蛋白主要以包涵體形式存在。

3 討 論

中國國土面積遼闊，地形復雜，培育適于各種極端環(huán)境條件且高產優(yōu)產的農作物是我們持之以恒的目標。青稞可以在青藏高原高海拔高寒的極端條件下生長良好，對環(huán)境有優(yōu)良的適應性，同時青稞自身具有一定的保健價值。因此，對于青稞這一特殊種植資源的利用具有很大的價值。同時，由于青稞屬禾本科，研究其遺傳背景對于選育高產優(yōu)產抗寒的農作物具有重要意義。

a中h:α螺旋，e:延伸鏈，t: β折疊，c:無規(guī)則卷曲h: alpha helix, e: extended strand, t: beta turn, c: random coil圖5 HbRPL19蛋白的二級結構和三級結構預測Fig.5 Prediction of secondary structure and tertiary structure of HbRPL19 protein

圖6 pET28a-RPL19重組質粒的雙酶切和重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.6 Double digestion of recombinant plasmid pET28a-RPL19 and SDS-PAGE analysis of the recombinant protein

葉綠體核糖體是植物特有的細胞器核糖體，主要功能是作為一個平臺，在這個平臺上，mRNA，tRNA和各種蛋白合成因子相繼組裝，來執(zhí)行譯碼和催化肽鏈的合成，負責著質體基因編碼的不到100個蛋白的合成。葉綠體核糖體由30 S和50 S兩個亞基構成，包含rRNA和50～100種獨特的蛋白[7]。在組成和行使功能的方式上，葉綠體核糖體與細菌的70 S核糖體非常相似，大部分葉綠體核糖體蛋白在大腸桿菌核糖體中都可以找到同源蛋白，其大約有45 %的平均序列一致性[11-12]。目前，葉綠體核糖體中rRNAs已經被完全確定，核糖體蛋白的功能也逐漸開始了相關研究[13-19]。顧志敏等[20]首次從單子葉的模式植物水稻中克隆了核糖體蛋白質S7基因，證明核糖體蛋白質在進化過程中的高度保守性。Yao等[21]成功分離了小麥中的15個核糖體蛋白質基因，并分析了其序列特性并進行了表達模式的檢測。本研究克隆得到的青稞HbRPL19屬于葉綠體核糖體50 S亞基的組成蛋白，其功能尚不清楚。我們在采用轉錄組測序和抑制性差減雜交技術對青稞的抗寒相關基因進行篩選的過程中發(fā)現，HbRPL19包含其中，推測其與青稞的抗寒性相關。因此，對HbRPL19基因進行了進一步的克隆和序列分析，同時，進行了原核表達，探究其在體外的表達情況。

4 結 論

在本研究中，我們成功獲得了青稞HbRPL19基因CDS全長序列及其編碼蛋白，為進一步研究HbRPL19蛋白與其它葉綠體內的蛋白質互作關系奠定了基礎。