李曉東 段世偉 曲 坤 白宏英 肖健豪 袁 倩 王運良△

1) 鄭州大學第二附屬醫(yī)院神經內科，河南 鄭州 450014 2) 寧波大學醫(yī)學院，浙江 寧波 315211 3) 中國人民解放軍第148醫(yī)院神經內科，山東 淄博 255300

腦卒中是目前導致死亡和殘疾的主要原因之一[1-2]，其中缺血性腦卒中(即腦梗死)占全部腦卒中的80%左右[3-4]。S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase，AHCY)、胱硫醚β合酶(cystathionine β synthase，CBS)是Hcy在體內代謝的關鍵酶之一，調節(jié)體內Hcy水平。研究表明，高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)為腦梗死新的獨立危險因素[5-9]。腦梗死是一種復雜的疾病，受遺傳和環(huán)境因素的共同作用[10-11]。表觀遺傳修飾被稱為遺傳學和環(huán)境的橋接因素[12]，且有研究表明，腦梗死患者中有DNA甲基化的異常改變[13-14]。而目前國內外尚無AHCY、CBS基因甲基化與腦梗死的相關報道。因此，我們將從表觀遺傳學角度探討AHCY、CBS甲基化水平與腦梗死的相關關系。

1 對象與方法

1.1研究對象選取2016-10—2017-04在解放軍第148醫(yī)院神經內科住院的152例腦梗死患者為病例組，均符合全國第4屆腦血管病會議制定的診斷標準[15]，并經顱腦CT或MRI確診，無意識障礙且能配合醫(yī)師進行體格檢查，男112例，女40例，年齡23～88(60.37±12.02)歲；選取同期152例與腦梗死組性別、年齡相匹配的健康體檢者為對照組，男112例，女40例，年齡30～90(60.45±12.23)歲。2組性別、年齡比較無顯著差異(P>0.05)，具有可比性。排除患有惡性腫瘤、神經系統(tǒng)退行性疾病、周圍血管疾病或周圍血管栓塞性疾病、血液病、嚴重肝腎疾病、內分泌代謝疾病、結核、結締組織疾病等。本研究經本院倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意。

1.2方法

1.2.1 標本收集：采集清晨空腹外周靜脈血2 mL，并加入EDTA抗凝管中，充分混勻，放入-80 ℃冰箱保存。收集研究對象的一般資料包括性別、年齡、同型半胱氨酸(Hcy)等生化指標。

1.2.2 外周血DNA提取、亞硫酸氫鹽修飾和熒光定量甲基化特異性PCR：用DNA提取試劑盒提取外周血DNA；用EZ DNA Methylation-Gold試劑盒對外周血DNA進行亞硫酸氫鹽修飾。qMSP(SYBR green-based quantitative methylation-specific PCR)是采用甲基化特異性引物和熒光染料SYBR Green I 對目的基因進行定量，再以ACTB基因作為內參基因對樣本間在模板量上的差異進行校正。甲基化特異性引物序列見表1。陽性對照為對健康人白細胞使用美國Thermo Scientifc公司甲基化轉移酶和亞硫酸氫鹽處理過的基因組DNA，空白對照為ddH2O。每次反應重復進行。DNA甲基化水平使用甲基化百分比參數(PMR)表示。

表1 AHCY、CBS基因甲基化特異性引物序列Table 1 methylation specific primer sequences of AHCY and CBS genes

注：F表示甲基化特異性上游引物，R表示甲基化特異性下游引物，(1)表示58 ℃時ACTB基因引物序列，(2)表示56 ℃時ACTB基因引物序列

2 結果

2.1 2組HHcy、Hcy水平比較2組HHcy、Hcy水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組HHcy、Hcy水平比較Table 2 2 groups of HHcy and Hcy levels

2.2 2組AHCY、CBS甲基化水平本文采用qMSP方法對病例組和對照組AHCY、CBS啟動子區(qū)甲基化水平進行定量分析，并采用中位數(四分位間距)表示甲基化百分比參數(PMR)水平。病例組AHCY基因PMR水平為0.16%(0.07%，0.32%)，對照組為0.25%(0.02%，0.67%)。如圖1所示，病例組AHCY甲基化水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。病例組CBS基因PMR水平為70.20%(49.19%，94.87%)，對照組為104.10%(74.65%，132.30%)。病例組CBS甲基化水平顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖1 病例組和對照組AHCY甲基化水平比較 圖2 病例組和對照組CBS甲基化水平比較Fig 1 Comparison of AHCY methylation level between case group and control group Fig 2 Comparison of CBS methylation level between case group and control group

2.3 2組AHCY甲基化水平亞組分析按性別進行亞組分析，結果表明病例組男性PMR水平低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，病例組女性PMR水平與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。按年齡進行亞組分析，按照不同年齡將全部研究對象分為3組：青年組(≤44歲)、中年組(45～59歲)、老年組(≥60歲)，結果顯示青年組腦梗死患者PMR水平與對照組比較無顯著差異(P>0.05)，而中年組和老年組腦梗死患者PMR水平與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4 2組CBS甲基化水平亞組分析按性別進行亞組分析，病例組男性、女性PMR水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。按年齡進行亞組分析，病例組青年組、中年組、老年組PMR水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

3 討論

隨著表觀遺傳學的發(fā)展，人類疾病與表觀遺傳學的研究成為熱點，所以表觀遺傳修飾為腦梗死發(fā)病機制的研究提供了新的方向。表觀遺傳學可以使基因表達產生可遺傳的改變，但DNA序列并不發(fā)生改變[16]，致使基因發(fā)生選擇性的表達或抑制[17-19]。而DNA甲基化是表觀遺傳學中研究最多的一種[20-21]，其在調控基因表達中起重要作用[22-25]。DNA甲基化可以調節(jié)許多基因的表達，當DNA甲基化異常時將引起相關疾病的發(fā)生，如腦卒中[26-29]、心血管疾病[30-32]、腫瘤[33-39]、糖尿病[40-44]、阿爾茨海默病[45-48]、精神疾病[49-51]等。

表3 2組AHCY甲基化水平比較Table 3 2 omparison of AHCY methylation levels

表4 2組CBS甲基化水平比較Table 4 2 comparison of CBS methylation levels

正?？崭範顟B(tài)下，人血漿中Hcy濃度為5～15 μmol，當體內Hcy濃度過高時則會導致HHcy的發(fā)生。一項前瞻性隊列研究的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，平均隨訪7.3 a后血清HHcy減少3 μmol/L，腦卒中患病風險降低24%[52]。另外，當人體內血漿Hcy升高5 μmol/L則腦梗死發(fā)病風險隨之增加約59%(OR=1.59；95%CI：1.30～1.95)；而Hcy降低3 μmol/L則腦梗死發(fā)病風險隨之下降約24%(15%～33%)[53]。本文結果顯示，HHcy、Hcy水平病例組與對照組比較均無顯著差異，與以往研究結果不符[54-55]，可能與藥物干預、飲食(補充葉酸、維生素B12、B6等)、樣本量較小及存在部分樣本信息缺失有關。

AHCY位于第20號染色體，含10個外顯子，編碼S-腺苷高半胱氨酸水解酶(AHCY)。AHCY可催化S-腺苷高半胱氨酸(SAH)可逆生成腺苷(Ado)和同型半胱氨酸(Hcy)，AHCY基因甲基化可能影響該酶的活性，使Hcy代謝障礙，引起HHcy。目前尚無AHCY基因甲基化與腦梗死的相關研究。本研究結果顯示，病例組AHCY基因甲基化水平與對照組比較無顯著差異，表明AHCY基因甲基化與腦卒中可能不存在相關關系。而亞組分析表明，男性腦梗死患者AHCY基因甲基化水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明AHCY基因甲基化可能與男性腦梗死患者發(fā)病相關。在不同年齡之間，中年組腦梗死患者AHCY基因甲基化程度高于對照組，而老年組AHCY基因甲基化程度低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示AHCY基因甲基化程度升高可能促使中年腦梗死患者發(fā)病，而AHCY基因甲基化程度減低可能與老年腦梗死發(fā)病相關。對比中年組與老年組AHCY基因甲基化水平與腦梗死患者的相關關系，結果存在分歧有待于進一步研究證實。綜合分析表明，AHCY基因甲基化與腦卒中可能不存在相關關系，具體機制有待深入研究。

CBS是位于第21號染色體，含17個外顯子，編碼胱硫醚β合成酶(CBS)。CBS不可逆的催化Hcy生成半胱氨酸和α-酮丁酸。目前，腦卒中在CBS基因突變方面研究較多[56-61]，基因突變致CBS活性降低，導致Hcy降解受阻，造成Hcy在血中蓄積而產生HHcy[62]，而CBS基因甲基化和腦卒中的研究尚無報道。本研究結果顯示，病例組CBS基因甲基化水平顯著低于對照組，分析CBS基因低甲基化為腦梗死發(fā)病的危險因素。按性別、年齡進行亞組分析，病例組無論男性、女性、青年組、中年組、老年組CBS基因甲基化水平均低于對照組，亞組分析結果再次表明CBS基因啟動子區(qū)低甲基化為腦梗死發(fā)病的危險因素。從上述結果分析，CBS基因低甲基化可能使CBS表達沉默，導致Hcy消耗減少，引起Hcy在體內異常蓄積形成HHcy，從而導致腦梗死的發(fā)生。綜合分析表明，CBS基因低甲基化可能為腦梗死危險因素。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，AHCY基因甲基化可能與腦梗死發(fā)病不相關，而CBS基因低甲基化與腦梗死發(fā)病相關。當前表觀遺傳學與腫瘤的相關研究較多，且在腫瘤的診斷、治療方面取得了重要進展。雖然腦卒中在表觀遺傳學方面的研究還處于起步階段，但隨著研究的深入，表觀遺傳學在腦卒中治療方面同樣會發(fā)揮重要作用。所以，我們認為Hcy代謝通路相關酶基因啟動子區(qū)甲基化與腦梗死相關研究對腦梗死的發(fā)病機制及診治方面提供了很好的前景。