李運(yùn)奇 尹先哲 湯 韜 趙智偉

1)南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，河南 南陽(yáng) 473012 2)南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 南陽(yáng) 473012 3)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)科，河南 洛陽(yáng) 471000

微血管增生是腦膠質(zhì)瘤一個(gè)重要的組織學(xué)特征[1-2]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤微血管通透性在預(yù)測(cè)病理分級(jí)、預(yù)后有重要意義[3]。病理分級(jí)不同的神經(jīng)膠質(zhì)瘤微血管增生的程度不同[4-5]。然而，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)CD105-MVD需要手術(shù)或活檢標(biāo)本，這可能會(huì)導(dǎo)致腦組織損傷和抽樣誤差。動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)磁共振成像(DCEMRI)可以通過(guò)分析對(duì)比劑分子通過(guò)的程度無(wú)創(chuàng)評(píng)估神經(jīng)膠質(zhì)瘤不成熟的微血管的通透性。本文研究DCE-MRI與CD105-MVD水平的關(guān)系，探討論在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中是否可以以非侵入性的方式(如DCE-MRI)評(píng)估MVD的程度。

1 資料與方法

1.1一般資料選取回顧分析南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院2014-11—2016-09經(jīng)臨床或者病理證實(shí)為腦膠質(zhì)瘤患者39例，診斷根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織(WHO)分類進(jìn)行[6]。男25例，女14例，年齡14～70(46±12)歲。病理分級(jí)Ⅱ級(jí)19例，Ⅲ級(jí)11例，Ⅳ級(jí) 9例。在接受DCE-MRI檢查之前，所有患者均未接受任何顱內(nèi)手術(shù)、化療或者放療等治療。

1.2方法選擇西門子3.0T超導(dǎo)MR儀，頭部正交線圈，對(duì)全部患者實(shí)施MRI平掃橫斷和冠狀、矢狀掃描。掃描參數(shù)，DCE-MRI使用以下執(zhí)行序列：強(qiáng)化前數(shù)據(jù)集的獲得采用T1WI作為基線(TR/TE，5.1/1.8 ms；視場(chǎng)角(FOV)240 mm×240 mm；矩陣138×192；掃描厚度、3.6mm)，翻轉(zhuǎn)角度2°和15°。DCE信號(hào)收集(TR/TE，4.9/1.9 ms；FOV，240 mm×240 mm；矩陣，138×192；掃描厚度3.6 mm)，翻轉(zhuǎn)角度12°，測(cè)量時(shí)間間隔為4.29 s。第五個(gè)基線數(shù)據(jù)獲得后，通過(guò)肘前靜脈注射釓雙胺注射液(Gd-DTPA-BMA；歐乃影，通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，挪威)，注射劑量為0.1 mmol/kg，速度4 mL/s。

1.3數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)傳入Siemens工作站，采用血流動(dòng)力學(xué)模型獲得腦組織的時(shí)間—信號(hào)強(qiáng)度曲線。采用Tofts和Kermode藥代動(dòng)力學(xué)模型計(jì)算Ktrans和Ve。通過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈段信號(hào)強(qiáng)度的變化得到動(dòng)脈輸入函數(shù)。通過(guò)同步觀測(cè)在軸向?qū)Ρ榷萒1WI成像和相應(yīng)的Ktrans和Ve參數(shù)圖確定Ktrans和Ve值。 ROIs區(qū)域被自動(dòng)轉(zhuǎn)移到軸向?qū)Ρ榷萒1WI成像和Ktrans和Ve參數(shù)圖中。每個(gè)腫瘤的ROI大小保持不變(半徑4～6 mm)。每個(gè)病人測(cè)量3次ROIs，選擇三次中Ktrans和Ve最大值。 ROI由神經(jīng)系統(tǒng)放射人員手工繪制。避開(kāi)ROIs區(qū)域中的囊性壞死，出血區(qū)域和正常的微血管區(qū)域。

1.4免疫組化染色和診斷39例膠質(zhì)瘤組織樣本全部經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的組織切片。CD105兔多克隆抗體(Abcam，美國(guó))作為一抗對(duì)MVD進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估，采用鏈霉菌抗生物素過(guò)氧化酶(SP)免疫組化法對(duì)切片進(jìn)行染色。顯微鏡下觀察組織切片染色情況，并應(yīng)用顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。病理診斷根據(jù)2016年WHO分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。以陽(yáng)性對(duì)照片和PBS代替一抗的陰性對(duì)照片進(jìn)行對(duì)照。陽(yáng)性切片的判斷：微血管出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽(yáng)性。用光密度值(OD)表示陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況。OD值=整合的光密度/構(gòu)成對(duì)象的像素?cái)?shù)。

2 結(jié)果

2.1 Ktrans、 Ve和CD105-MVD與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的關(guān)系低級(jí)別膠質(zhì)瘤(LGG)和高級(jí)別膠質(zhì)瘤(HGG)的平均Ktrans、Ve、CD105-MVD值如表1所示。LGG的Ktrans和Ve明顯低于HGG (P=0.001，P<0.001)。LGG的CD105-MVD明顯低于HGG(P<0.001)。Ⅲ級(jí)與Ⅳ級(jí)Ktrans、Ve和CD105-MVD無(wú)明顯差異。

表1 Ktrans、 Ve和 CD105-MVD與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的關(guān)系Table 1 Relationship between Ktrans，Ve and cd105-mvd and the pathological grade of glioma

2.2神經(jīng)膠質(zhì)瘤中Ktrans、Ve和CD105-MVD之間的相關(guān)分析在高病理級(jí)別的膠質(zhì)瘤(HGG)中Ktrans和Ve都與CD105-MVD呈正相關(guān)(r=0.698，P<0.001；r=0.682，P<0.001)。而低病理級(jí)別的膠質(zhì)瘤(LGG)中Ktrans和Ve與CD105-MVD無(wú)明顯相關(guān)性(圖1)。

3 討論

腫瘤血管生成是神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展中一個(gè)關(guān)鍵的過(guò)程，該過(guò)程為腫瘤入侵健康組織提供了充足的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[7-9]。目前，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，基于MVD的組織學(xué)方法評(píng)價(jià)腫瘤血管生成是一個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的獨(dú)立預(yù)后指[10-14]。目前的一些標(biāo)記物不能區(qū)分生理狀態(tài)下和病理狀態(tài)下的微血管增殖，如CD31[15-17]、CD34[18-20]、CD3[21-24]、CD20[25-26]和凝血因子Ⅷ[4]。因此，這些標(biāo)記物的免疫染色得出的MVD不能對(duì)微血管生成的程度提供一個(gè)準(zhǔn)確的估計(jì)。CD105是一個(gè)共受體，屬于TGF-beta家族，其表達(dá)與新生不成熟的微血管有關(guān)[12，27-28]。多項(xiàng)研究表明，CD105可能是一個(gè)特異的異常微血管生成標(biāo)記[29-31]。 CD105陽(yáng)性表示神經(jīng)膠質(zhì)瘤微血管程度高，腫瘤惡性程度高[32-34]。這些CD105陽(yáng)性的微血管通透性大，這會(huì)增加血管內(nèi)容物滲漏到血管外的組織間隙，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞入侵正常組織提供了條件[35-37]。之前有研究已經(jīng)確定，CD105在星形細(xì)胞瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)，CD105-MVD的表達(dá)水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理的等級(jí)成正相關(guān)[10]。本研究顯示，LGG中CD105-MVD的表達(dá)水平明顯低于HGG，HGG中的與腫瘤惡性程度相關(guān)的不成熟微血管可能會(huì)比LGG更多。Ⅲ和Ⅳ級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤之間的CD105-MVD的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。這可能是由于這兩個(gè)級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的微血管增生程度類似。臨床上檢測(cè)并評(píng)估CD105-MVD的表達(dá)水平方法復(fù)雜且費(fèi)用高。因此，無(wú)創(chuàng)性評(píng)CD105-MVD的表達(dá)情況從而間接得出不成熟微血管的增生和識(shí)別潛在的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤意義非同一般。

圖1 低級(jí)別膠質(zhì)瘤和高級(jí)別膠質(zhì)瘤MRI影像圖比較。A組從左到右依次為：病理級(jí)別Ⅱ級(jí)的膠質(zhì)瘤MRI (T1WI) 影像圖，Ktrans影像圖，Ve影像圖；B組從左到右依次為：病理級(jí)別Ⅳ級(jí)的膠質(zhì)瘤MRI (T1WI) 影像圖、Ktrans影像圖、Ve影像圖Figure 1 Comparison of MRI images of low grade glioma and high grade glioma.A group from left to right in turn：on the left side of the level of pathological Ⅱ grade of glioma MRI images of (T1WI)，images of Ktrans，Ve image；In group B，from left to right，the left pathological grade IV glioma MRI (T1WI) image，Ktranss image and Ve image were successively shown

這些初步結(jié)果可以作為進(jìn)一步驗(yàn)證的基礎(chǔ)。目前，該項(xiàng)研究還有諸多不足之處。在該項(xiàng)研究過(guò)程中，遇到了一些目前無(wú)法克服的問(wèn)題，如DCE-MRI數(shù)據(jù)處理前需要提前得到動(dòng)脈輸入函數(shù)(arterial input function，AIF)，AIF選擇不同的動(dòng)脈及其ROI選擇位置是否合理，都將顯著影響計(jì)算結(jié)果[38-39]，從而無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估組織微血管特性。最準(zhǔn)確的AIF應(yīng)該是目標(biāo)區(qū)的直接供血?jiǎng)用}，但由于空間分辨率受限，常常無(wú)法觀察到，因此常用掃描范圍內(nèi)的動(dòng)脈代替[40]。另外AIF與被檢者自身BMI指數(shù)、每搏輸出量有關(guān)，因此個(gè)體化AIF是最佳選擇，但其對(duì)時(shí)間分辨率要求較高，提高可重復(fù)性是臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素。時(shí)間分辨率、空間分辨率較低的情況下，考慮選擇Reference模型或者Population AIF[41]。運(yùn)動(dòng)位移在DCE-MRI數(shù)據(jù)中普遍存在，如：頭頸部，吞咽、舌頭及下顎的活動(dòng)；肺部及乳腺，呼吸運(yùn)動(dòng)、心臟跳動(dòng)；肝、腎，胃腸蠕動(dòng)等。AIF曲線由于血管運(yùn)動(dòng)不能夠真正反映對(duì)比劑進(jìn)人體內(nèi)的全過(guò)程。病灶邊緣由于運(yùn)動(dòng)位移模糊不清，直接影響病灶感興趣區(qū)勾畫，進(jìn)而對(duì)擬合病灶時(shí)間一信號(hào)強(qiáng)度曲線的真實(shí)度及準(zhǔn)確度產(chǎn)生誤差[42-44]。因此，運(yùn)動(dòng)校準(zhǔn)是很有必要的，校準(zhǔn)每一個(gè)像素點(diǎn)的位置，以保證計(jì)算結(jié)果的可靠性。

由DCE-MRI 得到的Ktrans和Ve對(duì)評(píng)估神經(jīng)膠質(zhì)瘤微血管通透性來(lái)講是一個(gè)非侵入性的理想的檢測(cè)方式[45-48]。DCE-MRI已經(jīng)證實(shí)HGG的微血管滲透率大于LGG[49]。本研究顯示，LGG的 Ktrans和Ve值明顯低于HGG。神經(jīng)膠質(zhì)瘤中不成熟的微血管通透性大，正常成熟的微血管內(nèi)皮完整，血管內(nèi)容無(wú)或分子的轉(zhuǎn)移受到有效的限制。

本文顯示，HGG中有更多的不成熟和高滲透性的微血管。但在異常的Ktrans或者Ve信號(hào)和病理標(biāo)本中很難執(zhí)行voxel-by-voxe對(duì)比。 因此，不能排除抽樣誤差所造成研究結(jié)果偏差的可能性。針對(duì)這一點(diǎn)我們假設(shè)高的trans和Ve信號(hào)代表高度不成熟的MVD腦部區(qū)域，其他區(qū)域依據(jù)于此進(jìn)行比較。

另外在圖像后期處理中，處理軟件所采用都是標(biāo)準(zhǔn)化的模型，該模型簡(jiǎn)化了一些數(shù)據(jù)處理工作，不能很好的評(píng)估一些數(shù)據(jù)的有效性。 如在該項(xiàng)研究中，血管內(nèi)的血清體積不能很好的被計(jì)算出來(lái)。采用合適的模型可能會(huì)更好地描述一些重要的生理參數(shù)和生物效應(yīng)。但是不同腫瘤類型，腫瘤部位和治療方法最適合的數(shù)據(jù)處理模型也不一樣[50]，因此我們只能采用目前被廣泛認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)化模型來(lái)進(jìn)行后期圖像處理。該研究還必須要考慮到等離子體體積的影響，該種影響一般情況下可忽略不計(jì)。但是這種影響可能導(dǎo)致在0.05～0.10 mL/g血管等離子體體積的范圍內(nèi)Ktrans會(huì)被略高估值。另一個(gè)可能導(dǎo)致數(shù)值估偏的原因是基線ROI模版。比如，明顯的腫瘤水腫或早期治療失敗，隨著腫瘤組織體積的增加，最終得到的DCE-MRI圖像可能無(wú)法真正的反映腫瘤增殖情況。本研究未觀察到這種情況，然而，非線性注冊(cè)方法，如彈性圖像算法可以用于獲取與串行成像研究相匹配的序列或。本研究的另一個(gè)局限是樣本量相對(duì)較小，需要大規(guī)模的病例研究更客觀地證實(shí)灌注量的估計(jì)和體內(nèi)腫瘤狀態(tài)之間的關(guān)系。