王 靜，蔣惠宇，張晶晶,張 華，彭孝軍

(1.大連理工大學 化工學院，遼寧 大連 116024;2.精細化工國家重點實驗室，大連理工大學，遼寧 大連 116024;3.北京市勞動保護科學研究所,北京 100054)

養(yǎng)心氏片是由黃芪、靈芝、黨參、丹參、葛根、地黃、當歸、淫羊藿、延胡索(炙)、山楂、甘草(炙)、黃連、人參 13 味中藥組成的中成藥，具有扶正固本、益氣養(yǎng)血、通脈止痛等功效[1]。臨床研究表明，養(yǎng)心氏片對心絞痛、冠心病、心力衰竭等疾病具有顯著療效[2-4]，可改善冠心病患者左心室收縮及舒張功能,降低超敏C反應蛋白水平，對冠狀動脈具有保護作用[5-6]。養(yǎng)心氏片的臨床應用安全性較高，不良事件發(fā)生率為0.17%[7-8]。作為復雜處方，養(yǎng)心氏片具有“多成分-多靶點-多途徑”的作用特點[9]，但其心血管保護作用的機制尚未充分闡明，還必須依賴于養(yǎng)心氏片的主要化學成分構成；對其化學成分的解析是加強養(yǎng)心氏片質量控制和安全性、有效性的重要保障。目前針對養(yǎng)心氏片的分析，僅有運用UHPLC-Q-TOF/MS技術進行定性分析[9]或運用HPLC方法對單一指標成分進行定量分析的報道，Yang等[10]建立了養(yǎng)心氏片中葛根素含量的HPLC測定方法，測得3批次養(yǎng)心氏片中葛根素的含量為1.93～2.51 mg/片；Sun等[11]建立了養(yǎng)心氏片中黃芪甲苷含量的HPLC/ELSD測定方法，發(fā)現(xiàn)3批次養(yǎng)心氏片中黃芪甲苷的含量為0.024%～0.027%。目前，關于養(yǎng)心氏片多組分化學成分同時定性及定量的分析方法尚未見報道。本研究利用高效液相色譜-高分辨飛行時間質譜(HPLC-TOF/MS)聯(lián)用技術，快速鑒定養(yǎng)心氏片化學成分；并采用高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質譜(HPLC-MS/MS)對其主要成分進行定量分析，從而建立了高效快速的養(yǎng)心氏片化學成分的定性定量分析方法，并對其質量進行了全面評價。

1 實驗部分

1.1 儀 器

Agilent 6224型 TOF LC/MS系統(tǒng)，包括1290 Infinity LC系統(tǒng)和G6224A TOF MS系統(tǒng)(美國安捷倫公司)；AB SCIEX QTRAP?4500 LC/MS質譜系統(tǒng)(美國AB公司)；Shimadzu LC-20AD UFLC系統(tǒng)(日本島津公司);Elmasonic S60H通用型超聲波清洗儀(德國艾爾瑪公司)；MS105DU型精密天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試 劑

黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、葛根素、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、小檗堿、表小檗堿、黃連堿、延胡索乙素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、甘草苷(分析純，99%，普菲德生物技術有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Tedia有限公司)；甲酸(色譜純，美國ACS恩科化學)。所有試劑均為分析純以上，實驗用水為超純水(Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國密理博公司)。養(yǎng)心氏片共10批，批號分別為160115、161101、161215、170601、151102、170702、170701、170210、171213、171111。

1.3 色譜-質譜條件

1.3.1HPLC-TOF/MS分析條件液相色譜條件：色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×3.0 mm,1.8 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)；梯度洗脫程序：0～25 min，5%～35% A；25～45 min，35%～ 100% A；45～50 min，100% A；50～55 min，100%～ 5% A；55 ～60 min，5% A；流速0.2 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量為20 μL。質譜條件：雙噴霧離子源(Dual ESI)，正/負離子掃描檢測方式；毛細管電壓為4 kV，碎裂電壓為150 V；干燥氣體溫度為350 ℃，干燥氣流速為 8 L/min，霧化氣壓力為35 psi。

1.3.2HPLC-MS/MS分析條件液相色譜條件：色譜柱為Waters XBridge?BEH C18(150 mm×4.6 mm,2.5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸(B)；梯度洗脫程序：0～10 min，25%～ 35% A；10～15 min，35%～100% A；15～20 min，100% A；20～21 min，100%～ 25% A；21～25 min，25% A；流速0.4 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量為10 μL。質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正負離子切換掃描檢測方式，動態(tài)多反應監(jiān)測模式(Scheduled MRM)；離子化電壓(IS)5.5 kV/-4.5 kV；溫度為500 ℃；噴霧氣(GS1,N2)壓力為50 psi；輔助加熱氣(GS2,N2)壓力為60 psi；氣簾氣(CUR)壓力為20 psi；碰撞氣(CAD)設為Medium。

1.4 樣品溶液的配制

1.4.1對照品溶液的制備以甲醇為溶劑分別制備質量濃度為40 mg/L的黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹參酮ⅡA、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、表小檗堿、延胡索乙素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1儲備液；以甲醇為溶劑分別制備質量濃度為1 g/L的小檗堿、黃連堿、丹酚酸B、甘草苷和葛根素儲備液。將以上儲備液存于4 ℃冰箱中待用。分別吸取各儲備液適量，制備混合對照品工作液。

1.4.2供試品溶液制備取養(yǎng)心氏片5片(批號161101)，去除糖衣，研磨成粉，過60目篩后，稱取200 mg樣品至200 mL容量瓶中，加入適量甲醇溶解，并超聲提取30 min，冷卻至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，取上清液過0.2 μm濾膜，濾液待分析。

2 結果與討論

2.1 提取方法的確定

考察了純甲醇、純乙醇以及不同比例的甲醇-水和乙醇-水對養(yǎng)心氏片中主要成分的提取率，結果表明純甲醇具有最高的提取率。同時，超聲(功率100 W，頻率40 kHz)輔助可以提高提取率。因此，確定提取方法為甲醇溶液超聲提取30 min。

2.2 色譜-質譜條件的選擇

2.2.1色譜條件考察了分別以甲醇和乙腈為流動相有機相的分離效果，結果表明，有機相為乙腈時，兩種分析方法的分離度均較理想，且在水相中加入0.1%甲酸后的色譜峰形優(yōu)于加入5 mmol/L乙酸銨，因此本文選擇乙腈-0.1%甲酸體系作為流動相。在HPLC-TOF/MS分析中，采用具有較高分離效率的ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×3.0 mm,1.8 μm)色譜柱進行分離，分析時間為60 min；在HPLC-MS/MS分析中，由于MRM模式具有較高的選擇性和靈敏度，為縮短分析時間，提高定量分析效率，選擇Waters XBridge?BEH C18(150 mm×4.6 mm,2.5 μm)色譜柱，在25 min內可完成定量分析。

圖1 供試品的HPLC-TOF/MS總離子流圖Fig.1 HPLC-TOF/MS total ion chromatograms of the sample solutionthe peak number denoted was the same as that in Table 1

2.2.2質譜條件樣品化學成分復雜，具有不同的質譜行為，因此HPLC-TOF/MS采用正負離子分別掃描的方法。HPLC-TOF/MS分析中，正離子模式鑒定出22種化合物，負離子模式鑒定出24種化合物，共推測出30種化合物；在HPLC-MS/MS分析中，也采用正負離子切換掃描的模式。選擇Scheduled MRM監(jiān)測模式定量分析16種化合物，以提高分析效率和靈敏度，實現(xiàn)了多種化合物的同時測定，不同化合物在各自的通道被檢測，且未產(chǎn)生相互干擾。

2.3 養(yǎng)心氏片化學成分的鑒定

“1.4.2”制備的供試品溶液經(jīng)HPLC-TOF/MS分析，得到的總離子流圖見圖1。

根據(jù)總離子流圖所得到的化合物精確分子質量信息，通過Agilent MassHunter Qualitative Analysis(B.06.00)軟件在5×10-6的質量偏差范圍內匹配分子式，并與文獻報道進行比對，對各化合物進行初步鑒定，共推測得到30種化合物，詳細信息列于表1。利用已有的標準對照品，鑒別出黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹參酮ⅡA等16種化學成分(圖2)。以正離子模式下的30號峰和負離子模式下的27號峰為例介紹鑒別過程。峰30和峰27的保留時間分別為43.12 min和29.90 min，質荷比分別為295.133 3和829.458 6。

表1 養(yǎng)心氏片成分定性分析Table 1 The qualitative analysis of ingredient compounds in Yangxinshi tablets

圖2 對照品的總離子流圖
Fig.2 Total ion chromatograms of the reference substance the number denoted was the same as that in Table 1

利用Qualitative Analysis軟件，限定誤差<5 ×10-6，匹配可能的分子式，并對比參考文獻中已知化合物的質荷比，確定峰30和峰27的分子式分別為C19H18O3和C41H68O14，加合峰分別為[M+H]+峰和[M+HCOO]-峰，與理論精確分子質量(295.132 9和829.459 1)和同位素分布情況進行比對，吻合良好(圖3)，推測峰30和峰27可能為丹參酮ⅡA和黃芪甲苷。最后，根據(jù)丹參酮ⅡA和黃芪甲苷標準對照品的保留時間、精確分子量、同位素分布等信息，確定峰30和峰27為丹參酮ⅡA和黃芪甲苷。

2.4 養(yǎng)心氏片化學成分的定量分析

2.4.1線性關系將16種混合對照品溶液依次稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍，取各濃度的混合對照品溶液各10 μL注入液質聯(lián)用儀，測定各化合物峰面積。以峰面積為縱坐標(Y)、對照品質量濃度為橫坐標(X，μg·L-1)，繪制標準曲線，得到回歸方程和相關系數(shù)。同法逐級稀釋，分別以信噪比(S/N)為3和10時的進樣濃度確定檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，如表2所示。16種分析物的線性相關系數(shù)均不小于0.997，在一定范圍內線性關系良好。LOD為0.039 1～78.1 μg·L-1，LOQ為0.156～312 μg·L-1。根據(jù)《中國藥典》的規(guī)定：養(yǎng)心氏片中黃芪甲苷的含量不得少于50 μg/0.3 g,16種分析物的線性范圍和定量下限均可滿足養(yǎng)心氏片樣品的分析要求。

表2 16種分析物的保留時間、線性關系、檢出限與定量下限Table 2 Retention times(RT)，linear relations，limits of detection(LODs) and limits of quantitation(LOQs) of 16 compounds

(續(xù)表2)

CompoundRT(min)Linear range(μg/L)Regression equationrLOD(μg/L)LOQ(μg/L)Epiberberine(表小檗堿)11.3062.5～2 000Y=67 200X-34 0000.997 00.4880.976Tetrahydropalmatin(延胡索乙素)11.506.25～200Y=201 000X+188 0000.998 30.1950.781Lithospermic acid B(丹酚酸B)11.80625～20 000Y=38.4X-10 7000.997 478.1312Coptisine(黃連堿)12.45156～5 000Y=29 300X+2 0300.999 60.3050.610Icariin(淫羊藿苷)13.36156～5 000Y=161X+46 5000.998 51.222.44Berberine(小檗堿)15.28625～20 000Y=8 110X+88 0000.997 40.1520.610Ginsenoside Rb1(人參皂苷Rb1)15.4415.6～500Y=147X-1580.998 30.7811.56Astragaloside Ⅳ(黃芪甲苷)15.99156～5 000Y=18.6X+2 1100.999 19.7619.5Tanshinone ⅡA(丹參酮ⅡA)21.740.625～20Y=204 000X+36 4000.999 90.039 10.156

2.4.2精密度、穩(wěn)定性、重復性及回收率取同一份供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，16種分析物的相對標準偏差(RSD)為1.6%～3.8%，表明儀器的精密度良好。

取供試品溶液，分別置于4 ℃冰箱中0、2、4、8、12、24 h后進樣，記錄峰面積。結果顯示，16種分析物的RSD為1.2%～3.4%，表明在24 h內供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

取同一批次藥材(批號161101)，精確稱取200 mg，共6份，按照“1.4.2”方法制備供試品溶液，準確吸取供試液10 μL進樣，測定峰面積，計算含量。6份樣品中，16種分析物的RSD為1.2%～3.7%，表明方法重復性良好。

精密稱取已知各成分含量的樣品200 mg，共6份，分別加入等量的對照品，按“1.4.2”方法制備供試品溶液，按“1.3”液相色譜-質譜條件進行測定，計算加標回收率。6份樣品中，16種分析物的平均回收率為96.8%～103.8%，RSD為1.0% ～3.5%，表明該方法準確度良好。

2.5 實際樣品的測定

分別稱取10批次樣品各200 mg，按“1.4.2”方法制備供試品溶液，按“1.3”液相色譜-質譜條件各測定3次，得相應色譜峰面積，代入回歸方程，計算16種成分的平均含量(表3,RSD≤4.4%)。對10批次養(yǎng)心氏片中16種成分進行檢測，含量高于1 mg/g 片芯的化合物有黃芪甲苷、丹酚酸B、葛根素、小檗堿和黃連堿。上述5種化合物均具有顯著的抗炎、抗氧化等活性，體內外研究證明其具有心血管保護活性[12-15]?！吨袊幍洹芬?guī)定，養(yǎng)心氏片中黃芪甲苷的含量不得少于50 μg/0.3 g。根據(jù)本研究測定結果，10批次養(yǎng)心氏片中黃芪甲苷的含量均高于該標準，但不同批次樣品中各成分的含量存在一定差異，如小檗堿和黃連堿不同批次的含量差異可達6倍，這可能源于藥材在采摘、加工、炮制過程中產(chǎn)生的誤差，進一步說明建立多指標成分同時測定的中藥復方制劑質量控制方法的必要性。

表3 10批次樣品中16種分析物的含量Table 3 Mean contents of 16 compounds in 10 batches

3 結 論

中藥化學成分研究是中藥現(xiàn)代化研究的基礎，本文建立了基于HPLC-TOF/MS的定性方法和基于HPLC-MS/MS的定量方法，對養(yǎng)心氏片中主要成分同時進行了定性分析和定量分析。推斷鑒定了養(yǎng)心氏片中30種成分，并對其中16種主要成分進行了HPLC-MS/MS定量分析。該方法操作簡便、結果準確，重復性好，為提高養(yǎng)心氏片的質量控制提供了可行性方法，也為其藥理研究和應用奠定了基礎。該方法可作為中藥中多組分同時定性和定量分析的參考方法。此外，養(yǎng)心氏片在臨床上用于慢性心力衰竭等病癥療效顯著，但其作用機理尚不明確，因此本文建立的HPLC-TOF/MS和HPLC-MS/MS方法對于建立養(yǎng)心氏片化學成分庫，進而闡明養(yǎng)心氏片抗心衰作用的關鍵靶點和通路也具有重要意義。