廖且根，張大文，羅林廣

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，江西 南昌 330200)

氯硝柳胺作為WHO推薦使用的殺螺藥，可用于滅殺水生環(huán)境中尾蚴階段血吸蟲(chóng)[1]，以及血吸蟲(chóng)的載體如釘螺[2]、斑馬貽貝[3]和福壽螺[4]。此外，氯硝柳胺可以殺死能捕食魚(yú)苗的魚(yú)，在水和光照條件下能自發(fā)降解[5-6]，主要降解產(chǎn)物為5-氯水楊酸(5-CSA)和2-氯-4-硝基苯胺(2C4NA)[7]，氯硝柳胺可作為理想的清塘劑。氯硝柳胺及其降解產(chǎn)物對(duì)水生生物具有毒副作用[8-9]。長(zhǎng)期反復(fù)使用將導(dǎo)致氯硝柳胺及其降解產(chǎn)物蓄積在底泥中，因此有必要建立底泥中氯硝柳胺及其降解產(chǎn)物的分析方法。

氯硝柳胺的測(cè)定方法有熒光法[10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[11-12]、高效液相色譜法(HPLC)[13-14]和電化學(xué)方法[15-16]。熒光法、電化學(xué)方法簡(jiǎn)單，但易受干擾，僅適用于簡(jiǎn)單體系，如水樣、藥劑；高效液相色譜法因靈敏度不高而應(yīng)用受限。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度和選擇性高，對(duì)于底泥樣品，仍需必要的前處理過(guò)程。底泥樣品的常用提取方法為索氏提取法，但該法萃取時(shí)間長(zhǎng)，有機(jī)溶劑消耗多，且需人工操作；更有效的自動(dòng)提取技術(shù)，如加速溶劑萃取(ASE)得到了廣泛應(yīng)用[17]。然而，ASE技術(shù)對(duì)分析物的選擇性較低，提取后樣品需凈化以除去同時(shí)提取的干擾物質(zhì)[18]。通過(guò)在ASE萃取儀內(nèi)放置足夠的吸附劑可實(shí)現(xiàn)萃取和純化同時(shí)進(jìn)行，減少了事后除雜的需要，并允許凈化步驟的自動(dòng)化。該技術(shù)已應(yīng)用于污泥和沉積物中一些新型和持久性污染物的分析[19-21]，常用吸附劑有硫酸化二氧化硅、C18和弗羅里硅土[22-24]。

本研究以中性氧化鋁為池內(nèi)吸附劑，加速溶劑萃取底泥中的氯硝柳胺及其降解產(chǎn)物。優(yōu)化了提取溶劑及種類、溫度、靜態(tài)時(shí)間、吸附劑種類及與樣品比例等加速溶劑萃取條件，并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了測(cè)試。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-1290Ⅱ-6495-MS/MS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，ASE350加速溶劑萃取儀(美國(guó)戴安公司)。氯硝柳胺(NIC)、5-氯水楊酸(5-CSA)和2-氯-4-硝基苯胺(2C4NA)純度分別為98%、99%、98.5%，均購(gòu)自Sigma公司；甲醇(色譜純，德國(guó)默克公司)；中性、酸性和堿性氧化鋁、乙二胺-N-丙基(PSA)、弗羅里硅土、C18和硅藻土購(gòu)于天津艾杰爾公司。實(shí)驗(yàn)用水為密理博純水機(jī)(德國(guó)默克公司)制備的二次水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

液相色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm,1.8 mm )；柱溫40 ℃；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為5 mL。 流動(dòng)相：A為水,B為甲醇。梯度洗脫條件：0～4 min,40% ～100% B；4～5 min，100% B;5～5.1 min，100%～40% B；5.1～6.0 min,40% B。

質(zhì)譜條件:Agilent 6495三重四極桿質(zhì)譜儀；ESI(-),毛細(xì)管電壓3 000 V，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件見(jiàn)表1。

表1 氯硝柳胺及其降解產(chǎn)物的質(zhì)譜條件Table 1 MS conditions of niclosamide and its degradates

1.3 樣品收集

所有底泥用抓斗式采泥器采集，含有40%～70%水分。底泥的理化性質(zhì)參照文獻(xiàn)[25]測(cè)定，采用pH 計(jì)測(cè)定底泥的pH值，重鉻酸鉀容量法測(cè)定有機(jī)質(zhì)含量，乙酸銨法測(cè)定陽(yáng)離子交換量(CEC)。測(cè)得所有底泥樣品的pH值范圍為 5.28～7.23，有機(jī)質(zhì)含量為8.5～63.2 g/kg，CEC含量為80.6～203 mol/kg。樣品經(jīng)冷凍干燥后，磨碎、過(guò)篩，置于干燥器中室溫保存。

1.4 樣品提取與凈化

底泥樣品用ASE 350加速溶劑萃取儀進(jìn)行萃取。在萃取池內(nèi)依次填入5 g中性氧化鋁、5 g底泥樣品和6 g硅藻土混合物，采用乙腈和水(3∶1，體積比)混合溶液萃取，萃取液加入氯化鈉飽和，液液分配后，轉(zhuǎn)移萃取液有機(jī)相的1/2至100 mL雞心瓶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干后，加入1.0 mL甲醇-水(4∶6，體積比)溶液溶解，過(guò)0.22 mm濾膜，待LC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 加速溶劑萃取條件的優(yōu)化

氯硝柳胺及其降解產(chǎn)物在極性和溶解性上有較大差異，提取溶劑的種類和比率選擇顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)選用乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)、乙酸乙酯(EA)和水作為單一或組合溶劑，提取結(jié)果顯示，采用單一溶劑提取時(shí)，其中1種或2種分析物的提取效率低，平均回收率低于60%，尤其是采用乙酸乙酯作提取試劑時(shí)，2-氯-4-硝基苯胺的回收率低于40%；而以乙腈-水組合溶劑提取時(shí)，回收率明顯增加，5-氯水楊酸和2-氯-4-硝基苯胺的回收率均超過(guò)70%，當(dāng)乙腈和水的體積比為3∶1時(shí)，氯硝柳胺及其降解產(chǎn)物的提取回收率最好，為80%～100%，因此實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-水(3∶1)為提取溶劑。

圖1 溫度對(duì)ASE萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on recovery

溫度是影響萃取效率的重要因素，升高溫度能增加溶劑的滲透性，降低分析物在基質(zhì)表面的吸附，從而提高萃取效率，但同時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致分析物降解，引入更多共提雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)考察了溫度(60、80、100、120、140 ℃)對(duì)ASE萃取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。在60～100 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，目標(biāo)分析物的提取回收率均增加，100 ℃時(shí)5-CSA的提取回收率達(dá)105%，氯硝柳胺和2-氯-4-硝基苯胺的提取回收率達(dá)95%。之后繼續(xù)升高溫度，提取回收率反而降低，140 ℃時(shí)氯硝柳胺的提取回收率約下降10%，這可能是由于氯硝柳胺存在部分降解。因此，實(shí)驗(yàn)選擇最佳萃取溫度為100 ℃。

靜態(tài)萃取時(shí)間和循環(huán)次數(shù)也是影響萃取效率的因素之一。實(shí)驗(yàn)對(duì)不同的靜態(tài)萃取時(shí)間(4、 8、10、20、30 min)和循環(huán)次數(shù)(1、2、3次)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，隨著萃取時(shí)間從 4 min 增至10 min，提取回收率約增加9%，繼續(xù)增加萃取時(shí)間，回收率反而降低，可能是共提的雜質(zhì)干擾所致。循環(huán)2次比循環(huán)1次的提取效率約增加10.2%，繼續(xù)增加循環(huán)次數(shù)，提取效率無(wú)明顯增大，反而增加了樣品前處理時(shí)間和共提雜質(zhì)。因此，實(shí)驗(yàn)選擇最佳的靜態(tài)萃取時(shí)間為10 min，循環(huán)2次。

圖2 吸附劑對(duì)凈化效果的影響Fig.2 Influence of sorbent type on the recovery

池內(nèi)凈化是通過(guò)在提取前加入不同吸附劑來(lái)實(shí)現(xiàn)共提雜質(zhì)的去除。實(shí)驗(yàn)分別考察了吸附劑種類(弗羅里硅土，中性、酸性和堿性氧化鋁，C18，PSA)以及吸附劑與樣品的質(zhì)量比(1∶2、1∶1、3∶2)對(duì)萃取效率的影響，結(jié)果如圖2所示。有水存在時(shí)，C18對(duì)氯硝柳胺有吸附作用，使得其提取回收率低于40%；而以PSA、酸性氧化鋁和堿性氧化鋁作為吸附劑時(shí)，5-氯水楊酸的提取回收率低于20%，可能是PSA和酸性氧化鋁通過(guò)靜電作用，而堿性氧化鋁通過(guò)氫鍵作用吸附5-氯水楊酸所致。以中性氧化鋁為吸附劑時(shí)，溶液更澄清，色譜峰信號(hào)顯著增加，干擾峰少，表明吸附劑對(duì)雜質(zhì)有移除效果；而弗羅里硅土對(duì)氯硝柳胺及其降解產(chǎn)物可能存在部分非特異性吸附，作為吸附劑時(shí)的提取效率均略低于中性氧化鋁。隨著吸附劑與樣品質(zhì)量比的增大，提取效率有所增加，當(dāng)比例從1∶2增至到1∶1時(shí)，提取效率約增加10%，繼續(xù)增大質(zhì)量比，提取效率增加不明顯。因此，實(shí)驗(yàn)選擇中性氧化鋁作為吸附劑，吸附劑與樣品量的質(zhì)量比為1∶1。

2.2 方法確證

在優(yōu)化條件下，于空白底泥基質(zhì)中加入氯硝柳胺及其降解產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)溶液，其在0.1～20.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999。以3倍和10倍信噪比計(jì)算得檢出限和定量下限分別為0.04～0.1 μg/kg和0.2 ～0.5 μg/kg(表2)，優(yōu)于目前已有方法對(duì)土壤中氯硝柳胺的檢出限50.0 μg/kg[26]和定量下限30.0 μg/kg[27]，且已有文獻(xiàn)方法不涉及對(duì)氯硝柳胺降解產(chǎn)物的分析。

表2 氯硝柳胺及其降解產(chǎn)物的檢出限、定量下限、平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 2 Limits of detection(LODs),limits of quantitation(LOQs),average recoveries and relative standard deviations(RSDs) of niclosamide and its degradates(n=5)

2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

在優(yōu)化條件下，對(duì)鄱陽(yáng)湖及其周邊池塘30個(gè)底泥樣品中的氯硝柳胺進(jìn)行分析，其中有5個(gè)樣品檢出氯硝柳胺殘留，殘留量為1.5～3.6 μg/kg，其余樣品未檢出氯硝柳胺及其降解產(chǎn)物。在未檢出的底泥樣品中，分別添加0.5、1.0、2.0 μg/kg 3個(gè)不同水平的氯硝柳胺及其降解產(chǎn)物儲(chǔ)備液，按照優(yōu)化的條件進(jìn)行萃取和測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。3個(gè)加標(biāo)水平下氯硝柳胺及其降解產(chǎn)物的平均回收率為 93.5%～101.9%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=5)為3.7%～6.7%。加標(biāo)樣品(2.0 μg/kg)的色譜圖見(jiàn)圖3。

3 結(jié) 論

本文建立了加速溶劑萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定底泥中氯硝柳胺及其降解產(chǎn)物的方法。方法的檢出限為0.04～0.1 μg/kg，回收率為93.5%～101.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%～6.7%。結(jié)果表明，方法具有萃取效率高，靈敏度好等特點(diǎn)，可用于實(shí)際樣品的分析。