劉先軍，羅 波，馮家力，曾 棟，李幫銳，陳東洋

(湖南省疾病預(yù)防控制中心，湖南 長(zhǎng)沙 410003)

抗病毒藥是一類(lèi)用于預(yù)防和治療病毒感染的藥物[1]，可用于治療流感，以及廣譜病毒感染如艾滋病、皰疹、肝炎等[2-5]。這些藥物最終會(huì)以原型或者代謝產(chǎn)物形式通過(guò)尿液或糞便排出體外，隨著生活污水、醫(yī)療廢水等排放進(jìn)入污水處理系統(tǒng)[6-9]。然而，目前的污水處理系統(tǒng)只能去除部分藥物[10]，對(duì)大多數(shù)藥物的去除效果不佳，有的幾乎未被去除[11]。而未被處理的藥物會(huì)隨著污水處理廠(chǎng)出水的排放再次進(jìn)入環(huán)境水體甚至飲用水，造成污染。Peng等[12]在珠江三角洲的污水處理廠(chǎng)及地表水中檢出阿昔洛韋，質(zhì)量濃度分別為177～406 ng/L和114～205 ng/L。

Sanderson等[13]對(duì)典型水生生物(藻類(lèi)、水蚤和魚(yú))的毒性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，抗病毒類(lèi)藥物位列最具毒性的藥物第8位；Schlüter-Vorberg 等[14]的研究證實(shí)，阿昔洛韋及其臭氧氧化產(chǎn)物可分別對(duì)大型蚤和綠藻產(chǎn)生明顯的慢性毒理作用。另外，野生鳥(niǎo)類(lèi)對(duì)抗病毒藥物已產(chǎn)生耐藥性[15]。因此，考察和了解環(huán)境中抗病毒類(lèi)藥物的存在水平和生態(tài)效應(yīng)具有較強(qiáng)的科學(xué)意義。

目前有關(guān)環(huán)境水體中抗病毒藥物的分析方法報(bào)道較少，已有報(bào)道主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[11-12]，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，是現(xiàn)階段痕量分析中最主要的技術(shù)手段，Prasse等[11]采用固相萃取柱凈化和液相色譜-質(zhì)譜法(SPE/LC-MS/MS)對(duì)廢水、河水及地下水中阿昔洛韋等10種抗病毒藥物進(jìn)行了分析，取得了較好的效果。但目前有關(guān)抗病毒藥物更昔洛韋、恩替卡韋、替比夫定及金剛烷胺在環(huán)境水體中存在水平的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究選擇伐昔洛韋、阿巴卡韋、恩替卡韋、齊多夫定、奈偉拉平、更昔洛韋、替比夫定、拉米夫定、阿昔洛韋和金剛烷胺10種抗病毒類(lèi)藥物為對(duì)象物質(zhì)，利用固相萃取富集凈化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了地表水中10種抗病毒藥物的分析方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITYTM超高效液相色譜-Xevo?-TQ-S質(zhì)譜儀(美國(guó) Waters公司)、MassLynx V4.1工作站。Oasis HLB(500 mg，6 mL)、Oasis MCX(500 mg，6 mL)固相萃取柱(美國(guó)Waters 公司)；ISOLUTE ENV+(500 mg，6 mL)固相萃取柱(瑞典Biotage 公司)；GF/A玻璃纖維濾紙(美國(guó)Whatman公司);甲醇、乙腈(HPLC級(jí)，Dikma公司)；甲酸(HPLC級(jí)，F(xiàn)luka公司)；氨水、鹽酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司)。伐昔洛韋、阿巴卡韋、恩替卡韋、齊多夫定、奈偉拉平、更昔洛韋、替比夫定、拉米夫定、阿昔洛韋、金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度均≥99%，加拿大Toronto Research Chemicals公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱(chēng)取伐昔洛韋、阿巴卡韋、恩替卡韋、齊多夫定、奈偉拉平、更昔洛韋、替比夫定、拉米夫定、阿昔洛韋和金剛烷胺對(duì)照品各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加適量甲醇使其溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取上述各成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇分別制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，避光于-18 ℃保存。

1.3 UPLC-MS/MS分析條件

1.3.1液相色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(100 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm)；柱溫：40 ℃；樣品溫度：4 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。流動(dòng)相：A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液，B為乙腈；流速為0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～1 min，99%A；1～2 min，99%～95%A;2～3 min，95%～70%A；3～5 min，70%～5%A；5～5.5 min，5%A；5.5～5.6 min，5%～99%A。

1.3.2質(zhì)譜條件電噴霧電離，正離子模式(ESI+)；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓：0.5 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：550 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；碰撞室壓力：3.1×10-3mbar。10種抗病毒藥物的質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 10種抗病毒藥物的UPLC-MS/MS檢測(cè)條件Table 1 UPLC-MS/MS acquisition parameters for antiviral drugs

(續(xù)表1)

CompoundRetention time/minMRM-transitions(m/z)Cone voltage/VCollision energy/eVAcyclovir(阿昔洛韋)2.23226.1>152.1*,226.1>135.13512,28Amantadine(金剛烷胺)3.86152.1>135.1*,152.1>93.13518,26

*quantitative ion

1.4 樣品前處理

地表水樣品于2017年4月5日取自湘江長(zhǎng)沙段。水樣經(jīng)GF/A(0.45 μm)玻璃微纖維濾紙過(guò)濾，4 ℃保存，在24 h內(nèi)進(jìn)行處理。

取1 000 mL水樣調(diào)至pH 7.0，以5～10 mL/min的速度通過(guò)預(yù)先用2 mL正己烷、2 mL丙酮、6 mL甲醇和6 mL超純水活化的ISOLUTE ENV+固相萃取柱。上樣完畢后，將小柱減壓抽干，用6 mL甲醇-丙酮溶液(體積比50∶50，含0.2%甲酸)洗脫，洗脫液在微弱的氮?dú)饬飨麓蹈?，然后用甲?水(體積比50∶50)溶液定容至1.0 mL，渦旋混合1 min，于4 ℃以10 000 r/min離心10 min，取上清液用于UPLC-MS/MS測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于MRM技術(shù)具有靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，因此，為實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境中目標(biāo)化合物的痕量分析，本實(shí)驗(yàn)采用MRM進(jìn)行檢測(cè)。首先，在流動(dòng)注射狀態(tài)下，分別將0.1 mg/L的10種抗病毒藥物的單標(biāo)溶液在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描以選擇適當(dāng)?shù)姆肿与x子峰和電離方式。結(jié)果表明：在正離子全掃描模式下，[M+H]+為最強(qiáng)峰，以其為準(zhǔn)分子離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，并對(duì)毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

在流動(dòng)相中加入少量甲酸能增加化合物在正離子檢測(cè)模式下的電離效率，促進(jìn)[M+H]+離子生成，因此正離子檢測(cè)模式下測(cè)定的目標(biāo)組分采用0.1%甲酸水溶液和乙腈作流動(dòng)相，優(yōu)化梯度洗脫條件。依據(jù)目標(biāo)化合物的理化性質(zhì)，比較了待測(cè)物在ACQUITY UPLC BEH C18、HSS T3及CORTECS C18色譜柱上的分離效果。結(jié)果顯示，恩替卡韋、齊多夫定、奈韋拉平、更昔洛韋和替比夫定在BEH C18和CORTECS C18柱的響應(yīng)和峰形比HSS T3柱好，且伐昔洛韋在BEH C18上的響應(yīng)遠(yuǎn)高于CORTECS C18柱，因此實(shí)驗(yàn)最終選擇BEH C18作為色譜分析柱。圖1為質(zhì)量濃度為5.0 μg/L 的10種抗病毒藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖。

2.2 固相萃取柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取技術(shù)對(duì)水體中目標(biāo)化合物進(jìn)行富集和凈化，選擇反相固相萃取小柱Oasis HLB、ISOLUTE ENV+和陽(yáng)離子交換小柱Oasis MCX進(jìn)行比較，用加標(biāo)為2 ng/L的1 000 mL超純水溶液(pH值分別為2.0、4.0、7.0和10.0)評(píng)價(jià)其回收率。結(jié)果表明：10種目標(biāo)物在HLB柱的回收率均低于50%，伐昔洛韋、齊多夫定、拉米夫定、阿昔洛韋和金剛烷胺的回收率低于10%，上樣液pH值的變化對(duì)該結(jié)果影響不明顯，這可能是因?yàn)槟繕?biāo)物的極性過(guò)強(qiáng)，在反相HLB上保留弱所致；在MCX柱上，伐昔洛韋和阿巴卡韋的回收率分別為29%和21%，其他8種抗病毒藥物的回收率均在50%以上，且pH 4.0時(shí)效果最佳；使用ISOLUTE ENV+柱時(shí)，目標(biāo)組分的回收率為73.0%～119.0%，且pH 7.0時(shí)回收率最高，與文獻(xiàn)研究結(jié)果基本一致[11]。這是因?yàn)镮SOLUTE ENV+柱是一種超交聯(lián)羥基聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物，利于從大量水樣中吸附極性化合物。因此，實(shí)驗(yàn)最終選擇ISOLUTE ENV+用于水樣的富集凈化(pH 7.0)。

2.3 線(xiàn)性范圍與定量下限

根據(jù)10種抗病毒藥物在質(zhì)譜中響應(yīng)的強(qiáng)弱配制不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在處理過(guò)的湘江水中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.4”方法進(jìn)行富集測(cè)定，分別以其峰面積(Y)對(duì)相應(yīng)質(zhì)量濃度(X，ng/L)進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，得10種目標(biāo)物的相關(guān)系數(shù)r2>0.993，結(jié)合整個(gè)方法的富集倍數(shù)和回收率計(jì)算出該方法對(duì)地表水中目標(biāo)化合物的定量下限(S/N=10)為0.2～5.0 ng/L(表2)。

2.4 回收率與精密度

取湘江水源水(總有機(jī)碳(TOC)為2.178 mg/L，pH 7.2 )加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度分別為2、5、10 ng/L，按最優(yōu)條件進(jìn)行處理和測(cè)定(表2)，得到平均加標(biāo)回收率為70.0%～104.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于15%。方法的回收率與精密度可滿(mǎn)足環(huán)境樣品中痕量污染物的分析要求。

表2 地表水中10種抗病毒藥物的線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量下限、加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Linear ranges,correlation coefficients(r2),limits of quantitation(LOQs),recoveries and RSDs of 10 antiviral compounds in surface water(n=6)

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)湘江長(zhǎng)沙某段水源水3次采樣樣品進(jìn)行檢測(cè)，均檢出阿昔洛韋、更昔洛韋和奈韋拉平(圖2)，質(zhì)量濃度分別為0.25～1.25、0.58～2.46、0.27～0.76 ng/L，阿昔洛韋的檢測(cè)結(jié)果與Peng等[12]對(duì)珠江水的報(bào)道結(jié)果基本一致。實(shí)際樣品中檢出更昔洛韋和奈韋拉平可能與不同地區(qū)抗病毒藥物的消費(fèi)使用情況不同有關(guān)。

3 結(jié) 論

本研究采用ISOLUTE ENV+固相萃取柱濃縮凈化和LC-MS/MS技術(shù)建立了同時(shí)檢測(cè)地表水中10種常用抗病毒藥物的分析方法，回收率和精密度均符合環(huán)境水樣中痕量污染物的分析要求。采用該方法對(duì)湘江水源水進(jìn)行檢測(cè)，檢出阿昔洛韋、更昔洛韋和奈韋拉平3種藥物。考慮到抗病毒藥物的潛在毒性效應(yīng)，應(yīng)對(duì)此類(lèi)藥物在醫(yī)療廢水及自然水體中的污染狀況和環(huán)境行為做進(jìn)一步研究。