劉珈伶，廖 強，蔣定之，陳寧周

(廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西 南寧 530001)

乳酸鏈球菌素(Nisin)，又稱乳鏈菌肽，是乳酸鏈球菌代謝產(chǎn)物中一種具有活性的抗菌蛋白或多肽[1]，由34個氨基酸殘基組成，能夠有效抑制大多數(shù)革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌[2-3]，1969年聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)確認(rèn)Nisin可用作食品防腐劑[4]。Nisin對蛋白水解酶極敏感，食用后迅速酶解成氨基酸，對人體無毒副作用[5]，已在全球60多個國家和地區(qū)作為食品添加劑廣泛使用。我國衛(wèi)生部于1990年批準(zhǔn)使用,GB 2760《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對食品中乳酸鏈球菌素允許使用的范圍和限量進行了規(guī)定。Nisin主要應(yīng)用于鮮乳及乳制品、肉及肉制品、罐頭食品、烘焙食品、飲料等食品保鮮[6]，在化工[7-8]和醫(yī)藥[9]等領(lǐng)域顯示了巨大的應(yīng)用潛力。

迄今已發(fā)現(xiàn)A、F、Q、U和Z 5種Nisin，其中以Nisin A和Nisin Z的研究最多，二者結(jié)構(gòu)相似，僅第27 位氨基酸殘基不同，Nisin A 為組氨酸，而 Nisin Z為天冬酰胺[10]。食品中Nisin的檢測方法有抑菌活性法、免疫學(xué)法、生物熒光法及其他方法。抑菌活性法包括比濁法[11]、瓊脂擴散法[12]等，其中我國目前執(zhí)行的GB 1886.231《食品添加劑 乳酸鏈球菌素》[13]中采用的方法為美國FCC瓊脂分散法；免疫學(xué)法有酶聯(lián)免疫吸附法[13]、斑點免疫印跡法[14]、多克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附法[15]等；生物熒光法有ATP生物發(fā)光測定法[16]、生物傳感器檢測法[17]等；其他方法包括高效液相色譜法[18]、分光光度法[19]等。但上述方法存在操作繁瑣，檢測時間長，特異性、專屬性弱，準(zhǔn)確性、精確性及重復(fù)性低的缺點，無法準(zhǔn)確鑒別Nisin的種類。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有特異性好和靈敏度高的特點，電噴霧電離源(ESI)易形成多電荷離子，特別適于分析極性強的大分子有機化合物[21]。多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)可實現(xiàn)一次質(zhì)譜進樣對幾百乃至上千個目標(biāo)肽段進行分析[22]。近年來應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析檢測培養(yǎng)液[23]、乳酪和牛奶[24-27]中Nisin也有報道，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)標(biāo)準(zhǔn)[28]還規(guī)定了乳酪中Nisin A的LC-MS和LC-MS/MS檢測方法。目前，在我國使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定Nisin尚屬空白。本文建立的HPLC-MS/MS快速測定鮮濕米粉中Nisin A和Nisin Z的方法，具有高效、準(zhǔn)確、可操作性強的特點，可為復(fù)雜基質(zhì)中多種生物防腐劑的檢測研究及標(biāo)準(zhǔn)制定提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

鮮濕米粉樣品購自廣西南寧市區(qū)內(nèi)部分超市、便利店及零售攤點。

Nisin A標(biāo)準(zhǔn)品(C143H230O37N42S7，生物試劑)、Nisin Z標(biāo)準(zhǔn)品(C141H228O38N41S7，生物試劑)均購于上海源葉生物科技有限公司；甲酸(色譜純，美國Fisher公司)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)；實驗用水為Milli-Q純水儀制備的超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)；pH 3.0的水為用甲酸溶液將超純水調(diào)至pH 3.0±0.1而得。除特殊注明外，所用試劑均為分析純，所配溶液均為水溶液。

AB SCIEX TRIPLE QUAD 4500高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；Heraeus MultifugeX3R型高速冷凍離心機(美國Thermo公司)；ML204型分析天平(感量0.000 1 g，瑞士Mettler-Toledo公司)；Rotavapor R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；Vortex Genie 2型渦旋振蕩器(美國Scientific Industries公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取乳酸鏈球菌素Nisin A、Nisin Z標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加pH 3.0的水溶解并定容至刻度，搖勻制得標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃冰箱儲存。精密移取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用pH 3.0的水稀釋并定容至刻度，搖勻制得質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。精密移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用空白基質(zhì)溶液制成質(zhì)量濃度分別為100、200、400、800、1 000、1 500、2 000 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

取試樣5 g(精確至0.000 1 g)置于50 mL離心管中，加10 mL pH 3.0的水溶液，渦旋1 min，放置30 min后，振搖渦旋5 min，4 500 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，取濾液待上機分析。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Hilic Plus柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫：35 ℃；流動相：0.1%甲酸(A相)、乙腈(B相)；梯度洗脫程序：0～3 min，80%～10%A；3～6 min，10%A；6～6.1 min，10%～80%A；6.1～9 min，80%A。流速：0.3 mL/min，進樣量：10 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；離子源溫度：600 ℃；干燥氣壓力：50.0 psi；氣簾氣壓力：35.0 psi；氣簾氣流速：30 L/min； 碰撞氣流速：6 L/min； 輔助氣流速：50 L/min；噴霧電壓：5 500 V；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；采集窗口：全段采集；駐留時間：100.00 ms； 其他參數(shù)見表1。

表1 乳酸鏈球菌素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Multiple reaction monitoring parameters of Nisin

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

首先采用C18、HLB和PRiME HLB 3種固相萃取柱考察了固相萃取法對陰性加標(biāo)樣品(質(zhì)量濃度1 000 μg/L)的提取凈化效果，結(jié)果顯示，Nisin A和Nisin Z均完全吸附于小柱上難以洗脫。隨后又分別考察了單獨采用不同極性有機溶劑飽和正丁醇水溶液和二氯甲烷對加標(biāo)樣品的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述溶劑對該測定體系的提取效果也極差。已有研究表明，Nisin A和Nisin Z耐酸性和耐熱性優(yōu)良，但在中性或堿性條件下即發(fā)生失活，在pH 2.0條件下，可耐受高溫處理且無活性損失[29]。隨著 pH值的升高，Nisin的溶解度大幅降低，當(dāng)pH 8.0時難溶于水。因此實驗考察了Nisin A和Nisin Z在pH 2.0～3.0的乙酸或甲酸水溶液中的溶解度。結(jié)果顯示，兩種乳酸鏈球菌素在該條件下溶解性良好，考慮到pH 2.0的溶液酸性過大，不利于質(zhì)譜維護，且乙酸的提取效果和離子化效果均比甲酸差，最終選擇用pH 3.0的甲酸水溶液渦旋提取樣品5 min。

2.2 高效液相色譜條件的優(yōu)化

比較了CAPCELL PAK C18柱(MGⅢ-H)、Hypersil Gold C8柱、ZORBAX Hilic Plus柱等液相色譜-質(zhì)譜分析中常用色譜柱的分離效果，結(jié)果顯示Hypersil Gold C8柱因保留時間較短，僅能分析Nisin A，且母離子為m/z567.1，子離子為m/z373.2和m/z431.0。CAPCELL PAK C18和ZORBAX Hilic Plus色譜柱均可分析Nisin A和Nisin Z，但CAPCELL PAK C18柱保留時間短，響應(yīng)低；ZORBAX Hilic Plus柱為親水作用色譜柱，適于分析強極性和強親水性物質(zhì)，對Nisin A和Nisin Z的峰形尖銳，保留時間延長至3 min后，分離度更好，實驗最終選擇ZORBAX Hilic Plus柱為分析柱。由于Nisin屬于大分子多肽，譜峰難以達到完美的對稱，實驗調(diào)整了流動相A中的甲酸濃度，并使用5～10 mmol/L乙酸銨增強離子化效果，擴大峰值的保留時間，調(diào)整譜峰對稱。實驗結(jié)果顯示,使用不同濃度乙酸銨調(diào)節(jié)的效果不理想，子離子峰仍出現(xiàn)分叉；而0.1%甲酸-乙腈為流動相時峰形對稱，保留時間適當(dāng)。實驗最終選擇流動相為0.1%甲酸-乙腈。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

分別考察了空白溶劑、樣品提取液在200、 1 000、1 800 μg/L 3個加標(biāo)水平下的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，Nisin A和Nisin Z在提取液中均存在嚴(yán)重的基質(zhì)抑制效應(yīng)，其中以空白溶劑的回收率為基準(zhǔn)，提取液Nisin A的回收率減少了53%，提取液Nisin Z的回收率減少了58%。由于本文未采用凈化處理，且目前市面上未見有Nisin A和Nisin Z的同位素內(nèi)標(biāo)，為減少基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響，本方法采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正的方式對定量結(jié)果進行校正。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

Nisin分子結(jié)構(gòu)中包含氨基丁酸(ABA)、脫氫丙氨酸(DHA)、R-甲基脫氫丙氨酸(DHB)、羊毛硫氨酸(ALA-S-ALA)和己-甲基羊毛硫氨酸(ALA-S-ABA)5種稀有氨基酸，活性分子常為二聚體或四聚體，在ESI源強電場作用下酸性溶液中的Nisin A和 Nisin Z容易質(zhì)子化，形成穩(wěn)定的多重電荷離子。分別配制500 μg/L的Nisin A和 Nisin Z標(biāo)準(zhǔn)溶液用針泵連續(xù)直接進樣，優(yōu)化了噴霧電壓、離子源溫度、氣簾氣、碰撞氣、輔助加熱氣、去簇電壓、碰撞氣能量等質(zhì)譜參數(shù)，以確定化合物的母離子和子離子。實驗監(jiān)測了Nisin A和Nisin Z的[M+4H]4+及[M+5H]5+峰，發(fā)現(xiàn)[M+5H]5+的質(zhì)荷比更高，對于多個帶電分子的分析而言，質(zhì)荷比越高特異性越強，因此實驗選擇的子離子質(zhì)荷比大于母離子，并以強度較大的子離子作為定量離子，以強度略小的子離子作為定性離子。圖1為陰性樣品中添加200 μg/L Nisin A和 Nisin Z混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后的總離子流圖，圖2為一陽性樣品的MRM定量離子色譜圖。

圖1 陰性樣品中添加Nisin A和Nisin Z混合標(biāo)準(zhǔn)物溶液的總離子流圖(200 μg/L)Fig.1 Chromatogram of blank sample spiked with Nisin A and Nisin Z(200 μg/L)

圖2 陽性樣品中Nisin A(A)和Nisin Z(B)的MRM定量離子色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of Nisin A(A) and Nisin Z(B) in a positive sample

2.5 分析方法評價

2.5.1線性關(guān)系與檢出限以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣，每個濃度進樣3次，以各組分峰面積(y)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，Nisin A和Nisin Z在100～2 000 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程分別為y=36.265x+697.77和y=63.228x+1 796.3，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999。但因LC-MS/MS的響應(yīng)值是絕對響應(yīng)值，基線噪音較高，流動相的噪音已在103以上，因此本實驗中線性方程的截距較大。根據(jù)對空白基質(zhì)的測定確定噪聲，以3倍信噪比(S/N=3)計算方法檢出限，平行測定3次，取平均值。測得Nisin A和Nisin Z的檢出限分別為0.01、0.02 mg/kg。

2.5.2回收率與精密度分別取10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.20、1.00、1.80 mL，加至5 g空白樣品中，按樣品同法處理，最終定容至10 mL，各水平平行測定6次，回收率結(jié)果如表2。Nisin A和Nisin Z的回收率為95.6%～107.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.2%～1.9%。說明本方法檢測結(jié)果可靠。以400 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液連續(xù)重復(fù)進樣6次，測得RSD均小于2.0%，說明本方法所得檢測結(jié)果重現(xiàn)性好。

表2 Nisin A和Nisin Z的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recoveries and relative standards of Nisin A and Nisin Z

2.5.3穩(wěn)定性實驗取10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1.00 mL，加入空白樣品中，按樣品同法處理并定容至10 mL，室溫下儲存，并于制備后0、2、4、8、12 h進行測定，每個時間段平行測定3次。結(jié)果顯示，Nisin A的質(zhì)量濃度為979.558～1 000.402 mg/L，RSD為0.85%；Nisin Z的質(zhì)量濃度為986.927～1 006.954 mg/L，RSD為0.79%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 實際樣品的測定

采用本法對市售20批鮮濕米粉樣品進行測定，樣品類型涉及即食類鮮濕米粉和非即食類鮮濕米粉的切粉(河粉、卷粉)和榨粉(圓粉)。結(jié)果有2批樣品檢出Nisin Z(含量分別為1.7、1.9 mg/kg)，1批樣品檢出Nisin A(含量為2.2 mg/kg)，其余均未檢出。檢出Nisin的批次占總批次的15%，檢出Nisin的3批次樣品均為保質(zhì)期大于3個月的即食類鮮濕米粉。本次檢測結(jié)果顯示，鮮濕米粉類產(chǎn)品中有添加乳酸鏈球菌素的現(xiàn)象。

3 結(jié) 論

本文建立了高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測定鮮濕米粉中兩種常見Nisin的檢測方法。以酸性溶液提取Nisin，以親水作用色譜柱Hilic Plus柱作為分析柱提高了分離效果，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)增強了離子的選擇性、抗干擾能力和專屬性。本方法簡單、快捷、準(zhǔn)確，所得檢測結(jié)果滿意，并首次實現(xiàn)了將液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于米粉中微生物防腐劑的檢測。方法也適用于醋、醬油等食品中乳酸鏈球菌素的檢測，可為食品安全標(biāo)準(zhǔn)的制定及風(fēng)險監(jiān)測工作提供技術(shù)支持。