邵梅琪, 陳 艷, 彭 青, 柳鵬福,2, 吳杰群,2, 儲(chǔ)消和,2*

(1. 浙江工業(yè)大學(xué)綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心, 浙江 杭州 310014; 2. 浙江省長(zhǎng)三角生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究園, 浙江 德清 313200)

氨基丁醇,在有機(jī)合成和藥物生產(chǎn)中有著廣泛的用途,是抗結(jié)核藥物鹽酸乙胺丁醇青霉烯類抗生素的重要中間體[1],其中R-3-氨基丁醇更是抗艾滋新藥不可缺少的手性源中間體[2]。

氨基丁醇沒(méi)有紫外吸收,目前關(guān)于此類氨基醇類物質(zhì)的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、HPLC-衍生化法、1H NMR和13C NMR等[3,4],如利用三氟乙酸酐衍生-氣相色譜法以及HPLC-衍生化法檢測(cè)氨基醇類的含量,但這些方法中衍生試劑的使用對(duì)色譜柱損傷較大[5,6];利用1H NMR、13C NMR和IR測(cè)定β-氨基醇的結(jié)構(gòu)和含量,對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求較高[7]。因此建立一種采用常規(guī)試劑和常用檢測(cè)設(shè)備(如高效液相色譜-紫外檢測(cè)器)測(cè)定氨基丁醇含量的方法具有重要意義。

自1952年Mulliken提出電荷傳遞理論(charge transfer theory)以來(lái)[8],荷移反應(yīng)引起了廣大科研人員的研究探索。荷移反應(yīng)是基于電子供體和電子受體間的電荷轉(zhuǎn)移從而形成荷移絡(luò)合物的一種反應(yīng),其絡(luò)合物往往具有顏色。利用荷移反應(yīng),可以調(diào)節(jié)藥物水溶性,增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性[9]。在檢測(cè)方面,由于荷移絡(luò)合物的形成能使吸收光譜發(fā)生較大幅度的紅移,并且在紫外或可見(jiàn)光區(qū)域具有較大的特定吸收峰,所以利用這個(gè)特性可以避開(kāi)其他物質(zhì)的干擾,提高檢測(cè)方法的選擇性[10]。

荷移反應(yīng)一般利用待測(cè)物質(zhì)作為電子供體，荷移試劑作為電子受體,如利用荷移-分光光度法來(lái)檢測(cè)馬來(lái)酸曲美布汀、卡維地洛、左氧氟沙星等含量[11,12];利用荷移-液相色譜法準(zhǔn)確快速測(cè)定硫酸西索米星以及硫酸胍基丁胺等無(wú)紫外吸收的物質(zhì)[13]。

目前用荷移-液相色譜測(cè)定氨基丁醇含量的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。氨基丁醇上氮原子存在孤對(duì)電子,能與缺電子的荷移試劑四氯苯醌(TCBQ)發(fā)生荷移絡(luò)合,本文研究了氨基丁醇和四氯苯醌的荷移反應(yīng),確定了檢測(cè)氨基丁醇的反應(yīng)條件以及色譜條件,建立了高效液相色譜法-紫外檢測(cè)器檢測(cè)氨基丁醇含量的方法。該法簡(jiǎn)便快捷,試劑穩(wěn)定,且重復(fù)性好,適用于氨基丁醇含量的快速檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-2030C高效液相色譜儀(日本島津公司); UV2800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(中國(guó)上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司); Mutiskan go DQ083酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司); ME54精密分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

氨基丁醇(分析純,阿拉丁試劑上海有限公司);甲醇(色譜純,美國(guó)Tedia公司);四氯苯醌、四硼酸鈉、硼酸和三乙胺(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 溶液的配制

精密稱取氨基丁醇0.1 g,置于100 mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,配制質(zhì)量濃度為1 g/L的氨基丁醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取四氯苯醌0.049 2 g,置于100 mL容量瓶中,用無(wú)水乙醇稀釋至刻度,配制濃度為0.002 mol/L的四氯苯醌溶液。

稱取硼砂1.907 g,加水至100 mL,配制成0.05 mol/L的硼砂溶液;稱取硼酸1.237 g,加水至100 mL,配制成0.2 mol/L的硼酸溶液。以體積比45∶55將硼砂溶液和硼酸溶液混合,配制成pH 8.4的硼酸-硼砂緩沖液。

1.3 荷移反應(yīng)條件

量取氨基丁醇標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL、四氯苯醌溶液5 mL和pH 8.4硼酸-硼砂緩沖液1 mL,置于10 mL具塞試管內(nèi),加水至刻度,于60 ℃水浴中反應(yīng)60 min,用水冷卻至室溫,于350 nm處檢測(cè)吸光度值。

1.4 分析條件

色譜柱:Agilent Extend C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:25 ℃;流動(dòng)相:A為0.001%(體積分?jǐn)?shù))三乙胺水溶液,B為甲醇;流速:0.8 mL/min。梯度洗脫程序:0～4 min, 5%B; 4～6 min, 5%B～50%B; 6～11 min, 50%B～5%B; 11～20 min, 5%B。進(jìn)樣體積：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 絡(luò)合物組成和反應(yīng)機(jī)理

分光光度法可以用來(lái)測(cè)定絡(luò)合物組成,且測(cè)定方法簡(jiǎn)便有效[14]。本實(shí)驗(yàn)采用等摩爾連續(xù)變化法測(cè)定絡(luò)合物組成及表觀穩(wěn)定常數(shù)。固定氨基丁醇和四氯苯醌物質(zhì)的量之和不變,連續(xù)改變二者物質(zhì)的量之比,進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)[15]。結(jié)果表明,氨基丁醇和四氯苯醌的配位比為1∶1,穩(wěn)定常數(shù)(K)為3.75×104。

氨基丁醇分子中有一個(gè)N原子,具有一對(duì)孤對(duì)電子,可以作為n-電子供體,四氯苯醌作為π-電子受體,兩者可形成n-π型絡(luò)合物,根據(jù)兩者的配位比推測(cè)氨基丁醇和四氯苯醌的荷移絡(luò)合物的形成機(jī)理,具體見(jiàn)圖1。

圖 1 氨基丁醇和四氯苯醌的荷移反應(yīng)機(jī)理Fig. 1 Charge transfer mechanism of aminobutanol and tetra-chloro-benzoquinone (TCBQ)

2.2 荷移反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

為確認(rèn)氨基丁醇與四氯苯醌荷移絡(luò)合物特定吸收峰的波長(zhǎng),本文按1.3節(jié)方法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行荷移反應(yīng),以氨基丁醇和四氯苯醌標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比,繪制吸收光譜圖(見(jiàn)圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),氨基丁醇在190～400 nm范圍內(nèi)無(wú)紫外吸收,四氯苯醌在215 nm和290 nm處有2個(gè)吸收峰,兩者形成的絡(luò)合物在215 nm和350 nm處有2個(gè)吸收峰,絡(luò)合物的吸收光譜發(fā)生了紅移。因此本文選擇350 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖 2 氨基丁醇、四氯苯醌和反應(yīng)產(chǎn)物的紫外光譜圖Fig. 2 Ultraviolet spectra of aminobutanol, tetra-chloro- benzoquinone and reaction product

2.2.2反應(yīng)介質(zhì)選擇

為考察反應(yīng)介質(zhì)對(duì)荷移反應(yīng)的影響,本文選擇水、甲醇、乙醇、丙酮和乙腈5種反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明,氨基丁醇和四氯苯醌在丙酮和乙腈中反應(yīng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生渾濁現(xiàn)象,在水、甲醇和乙醇等介質(zhì)中反應(yīng)時(shí),反應(yīng)液澄清透明,吸光度值分別為0.225、0.209和0.227,相差不大。因此根據(jù)實(shí)用性和簡(jiǎn)便性,本實(shí)驗(yàn)在水中進(jìn)行反應(yīng)。

2.2.3緩沖液pH值的選擇

為考察反應(yīng)體系的pH值對(duì)荷移反應(yīng)的影響,本文通過(guò)加入pH 4.0、5.0、6.0、6.6、7.0、7.4的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,7.8、8.0、8.4、8.7、9.0的硼砂-硼酸緩沖液和9.5、9.9、10.3、10.8的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液進(jìn)行試驗(yàn)(見(jiàn)圖3a)。氨基丁醇和四氯苯醌在酸性條件下基本不發(fā)生反應(yīng);在中性和堿性條件下,兩者發(fā)生荷移絡(luò)合反應(yīng)。反應(yīng)在pH 8.0～9.5范圍內(nèi)靈敏度較高,當(dāng)pH>9.5時(shí),絡(luò)合物吸光度值隨pH值的增大而下降。綜合考慮,選用pH 8.4的硼砂-硼酸緩沖液進(jìn)行反應(yīng)。

圖 3 (a)緩沖液pH值、(b)緩沖液用量、(c)反應(yīng)溫度、(d)反應(yīng) 時(shí)間和(e)TCBQ用量對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物吸光度值的影響(n=3)Fig. 3 Effect of (a) pH value of buffer, (b) the amount of buffer, (c) reaction temperature, (d) reaction time and (e) the amount of TCBQ on the absorbance of the reaction product (n=3)

2.2.4緩沖液用量的選擇

為考察緩沖液用量對(duì)荷移反應(yīng)的影響,分別加入pH 8.4的硼砂-硼酸緩沖液0.5、1、1.5、2.0、2.5和3.0 mL,按1.4節(jié)描述進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明,當(dāng)緩沖液用量大于1 mL時(shí),其用量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果幾乎無(wú)影響(見(jiàn)圖3b)。因此本實(shí)驗(yàn)最終采用硼砂-硼酸緩沖液1 mL。

2.2.5反應(yīng)溫度和時(shí)間的選擇

本文考察了反應(yīng)溫度(20、30、40、50、60、70、80和90 ℃)對(duì)荷移反應(yīng)的影響(見(jiàn)圖3c)。當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí),氨基丁醇和四氯苯醌的反應(yīng)已基本完全；反應(yīng)溫度大于80 ℃時(shí),反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度值有所降低。因此反應(yīng)溫度選擇60 ℃。

在60 ℃反應(yīng)溫度下分別反應(yīng)10、20、30、40、50、60、80、100 min,進(jìn)行反應(yīng)時(shí)間的考察(見(jiàn)圖3d)。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于60 min時(shí),氨基丁醇與四氯苯醌反應(yīng)完全。因此選擇的反應(yīng)時(shí)間為60 min。

2.2.6荷移試劑用量的選擇

為考察荷移試劑用量對(duì)反應(yīng)的影響,在1.4節(jié)描述的實(shí)驗(yàn)體系中分別加入0.002 mol/L四氯苯醌2、3、4、5、6和7 mL進(jìn)行試驗(yàn)(見(jiàn)圖3e)。結(jié)果表明,在用量2～5 mL時(shí),荷移絡(luò)合物的吸光度值隨四氯苯醌用量的增大而增大;當(dāng)用量大于5 mL時(shí),吸光度值基本不變。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇0.002 mol/L的四氯苯醌5 mL作為荷移試劑用量。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

氨基丁醇本身無(wú)紫外吸收,與荷移試劑TCBQ反應(yīng)絡(luò)合后形成的絡(luò)合產(chǎn)物在350 nm處有吸收峰,可用于高效液相色譜檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)選擇Agilent Extend C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)進(jìn)行分離,該色譜柱pH適用范圍寬(2.0～11.5),適用于大多數(shù)化合物的分析。色譜條件的選擇必須考慮以下要求:分離度(R)>1.5；理論塔板數(shù)不低于2 000；含量測(cè)定的RSD≤2% ；峰形窄而尖；分離時(shí)間短。

2.3.1流動(dòng)相的選擇

本文通過(guò)參考相關(guān)文獻(xiàn)[13],選擇以甲醇和水作為流動(dòng)相,并通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫程序,使荷移絡(luò)合物的色譜峰峰形較好且與空白溶劑分開(kāi)。但荷移絡(luò)合物的峰形有一定拖尾現(xiàn)象,因此在水相中加入不同體積分?jǐn)?shù)(0.001% 、0.005% 、0.010% 、0.015%和0.020% )的三乙胺，比較出峰情況。綜合考慮分離度、拖尾因子、理論塔板數(shù)以及色譜柱損耗等因素,最后選擇三乙胺的體積分?jǐn)?shù)為0.001% 。

2.3.2流速和柱溫的選擇

在上述條件下改變流動(dòng)相的流速(0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mL/min)以及柱溫(15、20、25、30和35 ℃)，考察其對(duì)峰形的影響。根據(jù)分離度和峰形,本文選擇流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃。

在最優(yōu)色譜條件下,對(duì)氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液荷移反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行分析,其色譜圖見(jiàn)圖4

圖 4 氨基丁醇標(biāo)準(zhǔn)溶液荷移反應(yīng)后反應(yīng)產(chǎn)物的色譜圖Fig. 4 Chromatogram of the reaction product after charge transfer reaction of aminobutanol standard solution

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制0.1、0.2、0.4、0.5和0.6 g/L的系列氨基丁醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,在1.3節(jié)條件下進(jìn)行荷移反應(yīng),在1.4節(jié)條件下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,氨基丁醇的峰面積(Y)與對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(X, g/L)在0.1～0.6 g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性方程為Y=8.870×106X+1.463×106,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 4。按信噪比3∶1和10∶1確定方法的檢出限和定量限,分別為0.003 g/L和0.010 g/L。

2.4.2回收率和精密度

在0.2 g/L的氨基丁醇樣品中分別加入3個(gè)水平(0.2、0.25和0.35 g/L)的氨基丁醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)添加水平做6個(gè)平行樣品,驗(yàn)證方法的重復(fù)性。結(jié)果表明,氨基丁醇的加標(biāo)回收率為98.3% ～103.6% , RSD為0.9% ～1.6% (見(jiàn)表1),證明該方法重復(fù)性好,數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

表 1 氨基丁醇的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 1 Recoveries and precisions of aminobutanol (n=6)

Background: 0.2 g/L.

2.4.3穩(wěn)定性

氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和TCBQ在1.3節(jié)條件下進(jìn)行反應(yīng)后,分別放置0、1、2、3、4和5 h,測(cè)定荷移絡(luò)合物的吸光度值,其結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.83%(n=5)。證明氨基丁醇和四氯苯醌的荷移絡(luò)合物穩(wěn)定性良好。

2.4.4實(shí)際樣品測(cè)定

采用本文描述的方法分析氨基丁醇樣品,將其與四氯苯醌進(jìn)行荷移反應(yīng),最后通過(guò)高效液相色譜進(jìn)行含量檢測(cè)。結(jié)果表明,氨基丁醇的含量為6.084 g/L,其色譜譜圖見(jiàn)圖5。

圖 5 實(shí)際樣品荷移反應(yīng)后反應(yīng)產(chǎn)物的色譜圖Fig. 5 Chromatogram of the reaction product after charge transfer reaction of the real sample

3 結(jié)論

本研究建立了一種利用荷移反應(yīng)和高效液相色譜-紫外檢測(cè)器快速檢測(cè)氨基丁醇的方法。該方法只需常規(guī)的紫外檢測(cè)器就可實(shí)現(xiàn)氨基丁醇的含量分析,具有操作簡(jiǎn)便、分析快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好等特點(diǎn),滿足日常檢測(cè)要求,適用于氨基丁醇含量的快速定性定量檢測(cè)。該方法可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)測(cè)定其他無(wú)紫外吸收脂肪族氨基醇類的含量。