程建橋, 張 峰, 許秀麗, 洪云鶴, 吳寒秋, 王傳勝

(1. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所, 北京 100176; 2. 沈陽化工大學(xué)應(yīng)用化學(xué)學(xué)院, 遼寧 沈陽 110142)

頭孢菌素(cephalosporin)類藥物是一大類具有β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的廣譜半合成抗生素(結(jié)構(gòu)通式如圖1),對革蘭氏陽性菌、陰性菌及螺旋體均顯示廣譜抗菌活性。主要用于治療人體因革蘭氏菌感染引發(fā)的各種炎癥,在畜牧養(yǎng)殖領(lǐng)域也常被用于防治奶牛乳房炎癥、胃腸道和呼吸系統(tǒng)感染。然而,頭孢菌素類藥物在畜牧養(yǎng)殖過程中的不規(guī)范使用會殘留在動物源性食品中,從而引發(fā)一系列食品安全問題,同時也有可能導(dǎo)致“超級細(xì)菌”的產(chǎn)生[1,2]。

圖 1 頭孢菌素類藥物的結(jié)構(gòu)通式Fig. 1 Structural formula of cephalosporins

從國內(nèi)外調(diào)查情況來看,乳制品中抗生素殘留情況較為嚴(yán)重[3]。長期攝入含抗生素殘留的動物源性食品,除藥物自身的毒副作用外,還可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)和腎臟損傷[4]。美國食品法規(guī)21號文件[5]中規(guī)定牛奶中頭孢噻呋最大殘留限量為100 μg/kg,頭孢匹林最大殘留限量為20 μg/kg;歐盟在食品中獸藥殘留的No. 37/2010文件[6]中對頭孢氨芐、頭孢乙腈、頭孢唑啉等8種頭孢菌素類藥物及頭孢匹林、頭孢噻呋兩種物質(zhì)的代謝物的最大殘留限量做了相關(guān)規(guī)定(含量在20 μg/kg與125 μg/kg之間);我國農(nóng)業(yè)部235號文件[7]規(guī)定了牛奶和奶粉中頭孢氨芐的最大殘留限量為100 μg/kg,頭孢噻呋的最大殘留限量為100 μg/kg,頭孢喹肟的最大殘留限量為20 μg/kg。

近年來高分辨質(zhì)譜(Q-TOF和Q-Orbitrap)在農(nóng)藥殘留、獸藥殘留檢測領(lǐng)域普及[8-11],但對于動物源性食品中頭孢菌素類藥物殘留分析的超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)篩查方法相關(guān)研究報(bào)道較少,僅檢索到一篇肉類中頭孢菌素類藥物篩查方法的報(bào)道[12],嬰幼兒奶粉中頭孢菌素類藥物殘留的篩查方法更未見報(bào)道,導(dǎo)致嬰幼兒奶粉及牛奶在質(zhì)量控制方面存在一定的安全隱患。嬰幼兒配方奶粉基質(zhì)復(fù)雜,蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、維生素及配方成分等有機(jī)雜質(zhì)較多,為高通量篩查方法的建立造成了一定的困難。近年來用于奶類樣品分析的前處理技術(shù)主要有固相萃取(SPE)[13,14]、QuEChERS[15-17]、液-液萃取(LLE)[18]及磁性固相萃取(M-SPE)[19,20]等,常見頭孢菌素類藥物的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)差異較大,傳統(tǒng)前處理方法大都只涵蓋化學(xué)性質(zhì)相似的幾種該類藥物[21-25],且不同前處理方法分多次處理同一批樣品會消耗大量的檢材和時間,很難達(dá)到日常篩查的目的。因此,有必要開發(fā)出一套適用于嬰幼兒奶粉中頭孢菌素類藥物的前處理技術(shù)及高通量篩查方法。

本研究針對復(fù)雜的奶粉基質(zhì),采用簡化的前處理同時結(jié)合超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)技術(shù),建立了一種快速篩查嬰幼兒奶粉中17種常見頭孢菌素類藥物殘留的分析方法。該法操作簡單,重現(xiàn)性好,分辨率高,可實(shí)現(xiàn)對嬰幼兒配方奶粉中17種頭孢菌素類藥物的篩查,已成功應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測中。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Q Exactive四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀,Dionex UltiMate 3000快速超高效液相色譜系統(tǒng)(美國賽默飛世爾科技公司); Allegra X-22R高速冷凍離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特有限公司); Milli-R04純水儀(德國Millipore公司); ML104/02分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司); HSC-12B針式氮吹儀(天津恒奧科技有限公司)。

頭孢菌素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品:頭孢米諾(cefminox)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢他美酯(cefetamet pivoxil)、頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢洛寧(cephalonium)、頭孢地尼(cefdinir)、去乙酰頭孢匹林(desacetylcephapirin)(純度>96% ,加拿大Toronto Research Chemicals Inc(TRC)公司);頭孢羥氨芐(cefadroxil)、頭孢唑啉(cefazolin)、頭孢拉定(cefradine)、頭孢匹林(cefapirin)、頭孢克洛(cefaclor)(純度>96% ,法國European Pharmacopoeia(EP)公司);頭孢匹胺(cefpiramide)、頭孢孟多(cefamandole)、頭孢吡肟(cefepime)、頭孢克肟(cefixmine)(純度>96% ,美國U. S. Pharma-copoeia(U. S. P)公司);頭孢哌酮(cefoperazone)(純度>96% ,德國Dr. Ehrenstorfer公司)。乙腈、甲醇、正己烷(色譜純,美國賽默飛世爾科技公司);甲酸(99% ,北京百靈威公司)。奶粉樣品為市售。

圖 2 17種頭孢菌素類藥物的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the 17 cephalosporins

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取頭孢菌素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g(精確至0.000 1 g),頭孢克洛以甲醇-水(1∶1, v/v)溶液定容至100 mL,其余頭孢菌素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品均以乙腈-水(4∶1, v/v)溶液定容至100 mL,配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,-40 ℃貯存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:移取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μL于容量瓶中,定容至10 mL,配制成1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液,-40 ℃貯存。每周配制一次。用乙腈將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液逐級稀釋,配制成系列工作液。

1.3 儀器條件

色譜條件:SUPELCO Ascentis?C8色譜柱(100 mm×4.6 mm, 3 μm);流動相A為水相,含0.1%(v/v)甲酸;B為乙腈。梯度洗脫程序:0～1 min, 5%B; 1～9 min, 5% ～95%B; 9～10 min, 95%B; 10～10.5 min, 95% ～5%B; 10.5～15 min, 5%B。流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣體積:5 μL;柱溫30 ℃;樣品盤溫度:8 ℃。

質(zhì)譜參數(shù):加熱電噴霧離子(HESI)源;鞘氣206.85 kPa;輔助氣1 000 kPa;噴霧電壓3.5 kV; S-lens電壓60 V;毛細(xì)管溫度300 ℃;輔助氣加熱溫度350 ℃;正離子采集模式;Full MS/dd-MS2(data-dependent MS2)掃描模式。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1 g(精確至0.001 g)奶粉樣品于50 mL聚丙烯離心管中,加入4 mL水渦旋至完全溶解后,再加入6 mL乙腈渦旋提取3 min,于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min。取上清液,過0.22 μm濾膜,待分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離

實(shí)驗(yàn)考察了3種色譜柱(Waters BEH Shield RP18 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm), Waters BEH HILIC (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和SUPELCO Ascentis?C8 (100 mm×4.6 mm, 3 μm))對目標(biāo)物的分離效果,結(jié)果表明:使用Shield RP18色譜柱對目標(biāo)物進(jìn)行分離時,部分物質(zhì)出現(xiàn)兩個目標(biāo)峰,這可能是由于目標(biāo)物在色譜柱中發(fā)生了分解;使用BEH HILIC色譜柱分離目標(biāo)物時,色譜峰展寬較嚴(yán)重,影響定量的準(zhǔn)確性;Ascentis?C8色譜柱適合用于頭孢菌素類藥物的分離,頭孢菌素類藥物色譜峰形改善,峰寬減小。

流動相的選擇對待測物的分離及質(zhì)譜檢測結(jié)果的影響很大。研究中,由于使用的超高效液相色譜系統(tǒng)是二元泵工作模式,頭孢菌素類藥物在乙腈-水溶液中的溶解性較好,因此流動相的有機(jī)相部分均選擇為純乙腈。選擇水相時對比了加酸與不加酸(0% ～1%(v/v)甲酸)對色譜峰形的影響,結(jié)果顯示,在使用0.1%(v/v)甲酸水-乙腈作為流動相時,色譜峰形較好,這是由于流動相中的甲酸與頭孢菌素類藥物中的氨基與羧基產(chǎn)生了積極的相互作用,促進(jìn)了電離。

圖2為優(yōu)化的儀器條件下,17種頭孢菌素類藥物的色譜圖。

2.2 質(zhì)譜條件的考察

對比Full MS、Full MS/dd-MS2和Target-SIM/dd-MS23種掃描模式:Full MS掃描模式下雖然可以達(dá)到對目標(biāo)物的定量檢測,但其僅以母離子精確質(zhì)量數(shù)和保留時間對目標(biāo)物進(jìn)行定性,易造成假陽性檢測結(jié)果;Target-SIM/dd-MS2掃描模式是先通過四極桿篩選出目標(biāo)母離子,母離子進(jìn)入高能碰撞池發(fā)生裂解,從而得到子離子碎片信息,提高了目標(biāo)物的定性檢測準(zhǔn)確性,但該掃描模式在對目標(biāo)物的定量上稍顯不足。最終選擇Full MS/dd-MS2掃描模式進(jìn)行目標(biāo)物的篩查監(jiān)測,以母離子和碎片離子精確質(zhì)量數(shù)定性,精確母離子定量,可達(dá)到對目標(biāo)物的篩查及定量目的。

在Full MS/dd-MS2掃描模式下,質(zhì)譜方法設(shè)置一級分辨率70 000,二級分辨率35 000, 歸一化碰撞能量(normalized collision energies,NCE)在25%時可得到最佳監(jiān)測結(jié)果,分辨率均小于1×10-6,見表1。

表 1 17種頭孢菌素類藥物的分子式、離子化方式、理論質(zhì)量數(shù)、精確質(zhì)量數(shù)和分辨率Table 1 Formula, ionization mode, theoretical mass, measured mass and mass accuracy for the 17 cephalosporins

2.3 前處理方法的選擇

17種頭孢菌素類藥物的極性、溶解性、穩(wěn)定性等存在很大的差異,為嬰幼兒奶粉中頭孢菌素類藥物篩查的前處理凈化帶來一定困難。因此,在前處理方式的選擇上,本研究對比了LLE、SPE、QuEChERS和直接提取-高速低溫離心處理的效果。

首先準(zhǔn)確稱取空白奶粉樣品1 g(精確至0.001 g)于50 mL聚丙烯離心管中,添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至含量為50 μg/kg,加入5 mL水渦旋至完全溶解,再加入5 mL乙腈渦旋提取3 min,于10 000 r/min離心10 min。取上清液,分別采用LLE、SPE、QuEChERS和直接提取-高速低溫離心處理方法進(jìn)行前處理，比較萃取效果。

2.3.1液-液萃取

取上清液(約5 mL),加入乙腈飽和正己烷溶液振搖約3 min,取下層清液過0.22 μm濾膜,上機(jī)檢測。由于提取過程中選用乙腈-水溶液作為提取溶劑,而水與正己烷互不相溶,乙腈微溶于正己烷,因此選用乙腈飽和正己烷溶液作為萃取液,除去提取液中的脂類雜質(zhì)。結(jié)果表明:僅有10種目標(biāo)化合物滿足回收率要求(60% ～120%),原因可能為乙腈飽和正己烷溶液雖然可除去奶粉中脂類及非極性雜質(zhì)干擾,但同時造成了部分低極性的頭孢菌素類物質(zhì)在凈化過程中的損失,導(dǎo)致回收率偏低。

2.3.2固相萃取

取2 mL上清液,過PRiME HLB固相萃取柱(6 mL, 200 mg, 美國Waters公司)。待樣品溶液全部流出后,加入2 mL 0.1%(v/v)甲酸-乙腈溶液淋洗,收集、合并全部流出液,氮吹至液體少于1 mL,用乙腈定容到2 mL,過0.22 μm濾膜,上機(jī)檢測。PRiME HLB固相萃取柱為雜質(zhì)吸附型固相萃取柱,不需要活化,上樣后收集流出液即可,最大限度地縮短了前處理時間。結(jié)果表明有12種化合物滿足回收率要求。研究中還對比了不洗脫、乙腈洗脫、0.1%(v/v)甲酸-乙腈溶液洗脫的效果,結(jié)果顯示0.1%(v/v)甲酸-乙腈溶液更適用于作洗脫液，這可能是由于甲酸改變了洗脫液的酸堿度,能使磷脂等雜質(zhì)吸附在PRiME HLB固相萃取柱上,而頭孢菌素類藥物則沒有保留。

2.3.3QuEChERS凈化

取上清液(約5 mL),加入0.9 g無水硫酸鎂,150 mg C18填料和150 mg乙二胺-N-丙基硅烷(PSA),振搖3 min后,靜置,取上清液,過0.22 μm濾膜,上機(jī)檢測。結(jié)果表明滿足回收率要求的僅9種化合物。此外,實(shí)驗(yàn)考察了C18填料、PSA以及QuEChERS方法組合凈化劑(MgSO4+PSA+C18)的凈化效果。結(jié)果顯示:在奶粉基質(zhì)中,組合凈化材料為(0.9 g MgSO4+150 mg C18+150 mg PSA)時基質(zhì)影響弱,回收率較高。

2.3.4直接提取-高速低溫離心

取上清液(約5 mL), 于4 ℃以10 000 r/min離心10 min,取2 mL上清液,過0.22 μm濾膜,上機(jī)檢測。使用直接提取-高速低溫離心的方式可使13種化合物的回收率在60% ～120%內(nèi),這可能是因?yàn)橹苯犹崛?高速低溫離心法最大限度地降低了頭孢菌素類藥物在凈化過程中的損失。乙腈提取去除了奶粉溶液中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)干擾,高速低溫離心去除了部分動物脂肪,因此,在嬰幼兒配方奶粉中頭孢菌素類藥物殘留篩查中,本研究選用操作簡單、節(jié)約資源的直接提取-高速低溫離心的前處理方法。

2.4 提取溶劑體積的選擇

配制50 μg/kg的奶粉加標(biāo)樣品,離心凈化,考察水和乙腈的體積(水體積+乙腈體積)分別為2 mL+8 mL、3 mL+7 mL、4 mL+6 mL、5 mL+5 mL、6 mL+4 mL、7 mL+3 mL和8 mL+2 mL時對17種頭孢菌素類藥物回收率的影響,結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，水、乙腈的體積為4 mL+6 mL時效果最好。

圖 3 提取溶劑中水和乙腈的體積對頭孢菌素類藥物 回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of volumes of water and acetonitrile in extraction solvent on the recoveries of cephalosporins (n=3)

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

準(zhǔn)確稱取1 g(精確至0.001 g)奶粉樣品于50 mL聚丙烯離心管中,加入4 mL水渦旋至完全溶解后,加入6 mL乙腈渦旋提取3 min,于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min。上清液即為奶粉樣品的空白基質(zhì)溶液?；|(zhì)效應(yīng)根據(jù)相同濃度的分析物在純有機(jī)溶液中與在空白基質(zhì)溶液中的響應(yīng)比值來評估,基質(zhì)效應(yīng)值根據(jù)方程(1)來計(jì)算[26,27]:

ME=B/A×100%

(1)

其中,A是指純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液獲得的峰面積,而B指的是標(biāo)準(zhǔn)品在空白基質(zhì)溶液中獲得的峰面積。結(jié)果如表2所示,經(jīng)提取-高速低溫離心處理后奶粉樣品的凈化效果良好,頭孢菌素類藥物基質(zhì)效應(yīng)為85.6% ～118.6%(n=5),在80% ～120%之間,不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。因此,該法可滿足嬰幼兒配方奶粉中頭孢菌素類藥物殘留的日常檢測需求。

2.6 方法驗(yàn)證

方法驗(yàn)證參照歐盟2002/657/EC和美國食品藥品監(jiān)督管理局生物分析程序指導(dǎo)手冊[28,29]進(jìn)行。驗(yàn)證中每組數(shù)據(jù)至少取5次平行測定的平均結(jié)果。

2.6.1線性關(guān)系、檢出限和定量限

配制17種頭孢菌素類藥物系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(5～200 μg/L),以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,17種化合物在5～200 μg/L內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,其線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。

注入一系列濃度的頭孢菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液到儀器中,以3倍信噪比確定儀器的檢出限(LOD);在空白樣品中分別添加一系列濃度的頭孢菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行前處理和測定,以10倍信噪比確定方法的定量限(LOQ)。如表2所示，各化合物的檢出限和定量限分別在0.006 0～0.040 μg/L和0.71～4.6 μg/kg范圍內(nèi),表明該方法具有較好的靈敏度,可以對含量較低的分析物進(jìn)行定量。

2.6.2回收率和精密度

在空白奶粉樣品中添加5、50、200 μg/kg 3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)1.4節(jié)處理后,每個水平重復(fù)測定5次,得到方法的回收率和精密度(見表3)。3個添加水平下17種頭孢菌素類藥物的回收率為69.6% ～101.4% ,精密度(RSD)小于10% 。

表 2 17種頭孢菌素類藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of the 17 cephalosporins

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

表 3 17種頭孢菌素類藥物的基質(zhì)效應(yīng)以及在奶粉中3個添加水平下的回收率、日內(nèi)精密度、日間精密度Table 3 Matrix effects and the spiked recoveries, intra-day precisions and inter-day precisions of the 17 cephalosporins at three levels in milk powder

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

2.7 實(shí)際樣品篩查

該法已經(jīng)成功地應(yīng)用于30例北京市售進(jìn)口嬰幼兒奶粉樣品中頭孢菌素類藥物篩查,結(jié)果顯示本次抽樣篩查結(jié)果良好,未見可疑頭孢菌素類藥物殘留。

3 結(jié)論

本研究建立了嬰幼兒配方奶粉中17種頭孢菌素類藥物殘留的超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)快速篩查方法。目標(biāo)物經(jīng)乙腈提取后,通過簡單的低溫高速離心達(dá)到凈化目的。使用C8色譜柱,Full MS/dd-MS2質(zhì)譜掃描模式,對17種頭孢菌素類藥物進(jìn)行了定性定量分析。該法操作簡單,重現(xiàn)性好,分辨率高,能同時對嬰幼兒配方奶粉中17頭孢菌素類藥物殘留進(jìn)行篩查定量。