唐 濤, 楊三東, 趙海青, 談義萌, 封 嬌, 夏明珠, 李 彤*

(1. 南京理工大學(xué)工業(yè)化學(xué)研究所, 江蘇 南京 210094; 2. 大連依利特分析儀器有限公司, 遼寧 大連 116023; 3. 大連市色譜工程技術(shù)研究中心, 遼寧 大連 116023)

液相色譜法是20世紀(jì)發(fā)展起來的重要分析方法,被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全、藥物分析等領(lǐng)域[1-3]。但是,隨著樣品復(fù)雜程度的增加,液相色譜的定性能力受到了越來越大的挑戰(zhàn),根據(jù)色譜保留時(shí)間定性容易受雜質(zhì)干擾、出現(xiàn)假陽性。以中藥組分分析為例,中藥的療效主要取決于有效成分的種類及含量,通常以其中某個(gè)組分的含量作為質(zhì)量控制點(diǎn)。在2015版《中國藥典》一部[4]中,新增和修訂的957個(gè)中藥品種有569個(gè)涉及液相色譜法,大部分以被測(cè)組分的保留時(shí)間作為定性依據(jù)。但由于中藥成分十分復(fù)雜,又經(jīng)過多種配伍,存在與目標(biāo)組分保留時(shí)間基本一致或相近的干擾物,采用液相色譜紫外-可見檢測(cè)法可能引起定性和定量結(jié)果的錯(cuò)誤[5]。因此,如何提高液相色譜法的定性能力是近年來儀器分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

提高色譜系統(tǒng)的分離能力,包括利用亞2 μm的超高效液相色譜[6]、使用具有超高柱效的超長色譜柱[7]及多維分離技術(shù)[8,9]等,可以降低定性的難度,但沒有真正提高系統(tǒng)的定性能力。另一種方式利用更多的聯(lián)用技術(shù),包括液相色譜-質(zhì)譜[10]、液相色譜-核磁共振[11]、液相色譜-原子熒光[12]等,這些方法在研究領(lǐng)域報(bào)道較多,但這幾類檢測(cè)器都十分昂貴,普適性不高,推廣難度較大。二極管陣列檢測(cè)器(DAD)作為較成熟的檢測(cè)器已被多個(gè)國外廠家和少數(shù)國內(nèi)廠家商品化,具有同時(shí)輸出全波段色譜圖和實(shí)時(shí)掃描光譜的功能[13]。Bitas等[14]采用HPLC-DAD法,在255和275 nm條件下完成了蝦中6種喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè);Ricciutelli等[15]利用二極管陣列檢測(cè)器獲取6個(gè)波長的色譜信息,同時(shí)定量檢測(cè)9種橄欖油中的多酚物質(zhì)。但在應(yīng)用方面,二極管陣列檢測(cè)器往往只是被作為一個(gè)多波長的、甚至普通的紫外-可見檢測(cè)器使用,光譜功能在定性上的應(yīng)用報(bào)道不多。在我們的前期工作[16]中,成功研制了二極管陣列檢測(cè)器,具有良好的儀器研制基礎(chǔ)。

基于自構(gòu)建的新型二極管陣列檢測(cè)器及其高分辨的光譜掃描功能,以色譜保留時(shí)間結(jié)合樣品吸收光譜圖為定性原則,對(duì)中藥樣品進(jìn)行了分析,有效避免了假陽性結(jié)果,為中藥組分分析提供了參考方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

iChrom 5100高效液相色譜系統(tǒng),配置有二極管陣列檢測(cè)器(自構(gòu)建)、P5102二元高壓恒流泵、M5102系統(tǒng)組織器、S5101自動(dòng)進(jìn)樣器、O5101色譜柱恒溫箱和W5100色譜數(shù)據(jù)工作站,SinoChrom ODS-BP色譜柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm)、SinoChrom ODS-BP色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和SinoPak C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)(大連依利特分析儀器有限公司); AE100S電子天平(瑞士Mettler Toledo公司); WB-1010A恒溫水浴鍋(天津奧特賽恩斯儀器有限公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國密理博公司)。

五味子醇甲對(duì)照品(純度≥99% )和金胺O對(duì)照品(純度≥99% )(中國藥品生物制品檢定所);甲醇和乙腈(均為色譜純,美國Tedia試劑公司);乙醇、磷酸二氫鉀、三乙胺、碘化鈉和亞硝酸鈉(均為分析純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);棗仁天麻膠囊、黃柏、延胡索、黃連、菟絲子、石斛和蒲黃均為市售商品。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1二極管陣列檢測(cè)器的評(píng)價(jià)

雜散光測(cè)試:稱取10.0 g碘化鈉和50.0 g亞硝酸鈉,分別配制10 g/L的碘化鈉水溶液和50 g/L的亞硝酸鈉水溶液。使用注射器將空白水溶液注入檢測(cè)池,待檢測(cè)器示值穩(wěn)定后,掃描背景光譜;再分別注入碘化鈉和亞硝酸鈉水溶液,掃描透過光譜。觀察碘化鈉水溶液在220 nm、亞硝酸鈉水溶液在340 nm是否透光,透光說明存在雜散光。

氧化鈥玻璃濾光片測(cè)試:打開氘燈,等能量讀數(shù)穩(wěn)定,掃描氘燈光譜,記錄每個(gè)光電二極管能量值En;將氧化鈥玻璃置于檢測(cè)池前端,穩(wěn)定幾秒后再次掃描光譜,記錄能量值En′。計(jì)算透過率Tn=En′/En,繪制透過率曲線,并讀取特征吸收值與理論值(241.6、279.2、287.6、360.6、445.6和536.3 nm),進(jìn)行比較,計(jì)算偏差。

1.2.2金胺O的測(cè)試

金胺O對(duì)照品溶液的配制:稱取金胺O對(duì)照品50.0 mg,用70%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇水溶液溶解并定容到100 mL容量瓶中,制成500 mg/L金胺O對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別用70%乙醇水溶液稀釋上述儲(chǔ)備液,定容至10 mL,得到質(zhì)量濃度為0.5、1.0、10.0、25.0、50和100 mg/L的金胺O標(biāo)準(zhǔn)工作液。

樣品前處理:取2.0 g藥材粉末樣品于50 mL具塞錐形瓶中,加20 mL 70%乙醇水溶液,超聲提取20 min,提取液用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾,取濾液進(jìn)樣分析。

色譜條件:流動(dòng)相為35∶65(v/v)的乙腈-0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液(含0.2%三乙胺,用磷酸調(diào)pH值至3.0);色譜柱為SinoChrom ODS-BP(250 mm×4.6 mm, 5 μm);檢測(cè)波長為432 nm;流量為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為20 μL;溫度為室溫。

1.2.3五味子醇甲的測(cè)試

五味子醇甲對(duì)照品溶液的配制:稱取2.3 mg五味子醇甲對(duì)照品,置于50 mL容量瓶中,純甲醇超聲溶解并定容后作為儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取儲(chǔ)備液2 mL于10 mL容量瓶中,用純甲醇稀釋后定容,即得9.2 mg/L的五味子醇甲對(duì)照品溶液。

棗仁天麻膠囊樣品前處理方法:取裝量差異下的棗仁天麻膠囊適量,混勻后研細(xì),精密稱取0.50 g粉末于100 mL具塞錐形瓶中,精確加入80%甲醇水溶液50 mL,密塞,稱定重量。在80 ℃水浴中加熱回流20 min,冷卻至室溫,再稱定重量,用80%甲醇水補(bǔ)足減失的重量。搖勻,過濾,取濾液,即得供試品溶液。

色譜條件:流動(dòng)相為55∶45(v/v)的甲醇-水;色譜柱為SinoPak C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)和SinoChrom ODS-BP(200 mm×4.6 mm, 5 μm);檢測(cè)波長為250 nm;流量為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為20 μL。

圖 1 二極管陣列檢測(cè)器Zemax模擬圖Fig. 1 Zemax simulated diagram of diode array detector (DAD)

2 結(jié)果與討論

2.1 二極管陣列檢測(cè)器的構(gòu)建與評(píng)價(jià)

以橢球鏡、輪胎鏡和平場(chǎng)光柵為主要光學(xué)件,設(shè)計(jì)并組裝了一種全新的二極管陣列檢測(cè)器,其Zemax光路模擬圖見圖1。光源和檢測(cè)池分別放置在橢球鏡的兩個(gè)焦點(diǎn)位置,氘燈發(fā)出的光首先通過光闌,經(jīng)過橢球鏡聚焦到檢測(cè)池中心;通過檢測(cè)池的出射光照射到輪胎鏡上,然后聚焦到狹縫,進(jìn)一步經(jīng)過平場(chǎng)光柵分光,成像到陣列探測(cè)器上;再經(jīng)過光電轉(zhuǎn)換成信號(hào)值。

圖 2 (a) Zemax成像模擬結(jié)果和(b)氘燈光譜圖Fig. 2 (a) Simulation results of Zemax imaging and (b) the spectrogram of the deuterium lamp

選取氘燈光譜的3個(gè)特征波長254、486和656 nm作為輸入?yún)?shù),利用Zemax軟件模擬光路方案成像效果,結(jié)果如圖2a所示。成像光斑的均方根半徑值和幾何半徑值均小于1 mm, 3個(gè)波長成像點(diǎn)位置重合,說明在理論上設(shè)計(jì)的光路沒有色差,成像質(zhì)量好。利用碘化鈉和亞硝酸鈉水溶液分別在220和340 nm測(cè)試透過率,結(jié)果顯示無雜散光。傳統(tǒng)的二極管陣列檢測(cè)器,通常采用透鏡組的結(jié)構(gòu),并利用多組黑擋片減弱色差對(duì)成像的影響。本文設(shè)計(jì)的二極管陣列檢測(cè)器采用離軸非球面反射的原理,設(shè)計(jì)了雙焦點(diǎn)的橢球鏡和高反射效率的輪胎鏡兩個(gè)關(guān)鍵器件,從光路設(shè)計(jì)上將色差和雜散光的影響降到最低。

將氘燈置于光源位置,測(cè)試光譜圖如圖2b所示,特征峰486.0和656.1 nm峰形尖銳。以兩點(diǎn)特征波長值與陣列數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行線性擬合,得到方程為y=1.13x+186.28,y為特征波長值(單位nm),x為陣列數(shù)。進(jìn)一步利用氧化鈥玻璃濾光片的6點(diǎn)特征波長驗(yàn)證系統(tǒng)波長準(zhǔn)確性,結(jié)果最大偏差為0.8 nm。汞燈是一種理想的多波長線光源,將其置于光源位置,測(cè)試光譜圖,特征線253.7 nm的半峰寬為1.9 nm。與常規(guī)色譜用紫外-可見檢測(cè)器8～10 nm水平相比,性能提高約5倍,接近商品化紫外-可見分光光度計(jì)指標(biāo),有利于采集準(zhǔn)確的樣品光譜信息,這也是利用光譜進(jìn)行輔助定性的重要保障。

2.2 金胺O測(cè)試結(jié)果

金胺O是一種化學(xué)染色劑,對(duì)人體有一定毒性作用,被列為非食用物質(zhì),在中藥材、中藥飲片和中成藥中均不得檢出。但一些不法商販將其用于劣質(zhì)黃柏、蒲黃、延胡索等中藥材、中藥飲片的非法染色。2015年,國家食品藥品監(jiān)管總局曾通報(bào)了9批次中藥及中藥飲片檢出金胺O[17]。

采用50 mg/L的金胺O標(biāo)準(zhǔn)溶液,連續(xù)5次進(jìn)樣,保留時(shí)間和峰面積RSD值分別為0.42%和0.79% ,說明系統(tǒng)穩(wěn)定性良好。以標(biāo)準(zhǔn)工作液為分析對(duì)象,按質(zhì)量濃度從低到高進(jìn)樣,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線,y=66.17x+3.35(y為峰面積,x為質(zhì)量濃度,單位為mg/L),相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9,說明該方法線性相關(guān)性良好。以3倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為儀器檢出限,10倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為儀器定量限,得到檢出限為0.02 mg/L,定量限為0.06 mg/L。

以市售的黃柏、延胡索、黃連、菟絲子、石斛和蒲黃為檢測(cè)對(duì)象,采用1.2.2節(jié)方法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見圖3a。以保留時(shí)間為考察指標(biāo),金胺O對(duì)照品出峰時(shí)間為12.48 min,黃柏、延胡索、黃連、菟絲子、石斛5種藥材樣品譜圖在對(duì)應(yīng)出峰時(shí)間位置均無明顯出峰,說明不含金胺O。蒲黃樣品譜圖中12.55 min有0.58 mAU的未知組分峰檢出。為進(jìn)一步確證,提取了對(duì)照品和未知組分的光譜圖(見圖3b)。未知組分光譜圖及特征吸收峰與對(duì)照品截然不同,說明未知組分不是金胺O。

圖 3 (a)金胺O對(duì)照品和中藥飲片色譜疊加圖和(b)金胺 O對(duì)照品和蒲黃中未知組分吸收光譜疊加圖Fig. 3 Stacked chromatograms of (a) auramine O reference and herbal slices, and (b) auramine O reference and unknown component in pollen typhae

2.3 五味子醇甲測(cè)試結(jié)果

五味子是一味中藥,2015版《中國藥典》一部[4]中將采用液相色譜法測(cè)定五味子醇甲作為五味子含量測(cè)定的推薦方法。棗仁天麻膠囊是由酸棗仁、五味子、天麻等組成的復(fù)方中成藥,主要用于改善睡眠。以市售某品牌棗仁天麻膠囊為樣品,按1.2.3節(jié)方法測(cè)試,采用不同品牌的C18色譜柱分析,結(jié)果見圖4。由于不同固定相作用力的差異,對(duì)照品出峰時(shí)間分別為11.29和27.41 min,樣品中兩個(gè)未知組分在圖4a和圖4b中分別與對(duì)照品出峰時(shí)間對(duì)應(yīng),疑似目標(biāo)成分。

圖 4 不同色譜柱分析五味子醇甲對(duì)照品和樣品色譜疊加圖Fig. 4 Stacked chromatograms of the schisandrin reference and the sample with different chromatographic columns a. SinoPak C18; b. SinoChrom ODS-BP.

提取對(duì)照品和樣品中兩個(gè)未知組分峰的光譜圖,如圖5所示,未知組分1在301.2 nm有明顯吸收,對(duì)照品在此波長下基本沒有響應(yīng);未知組分2最大吸收峰出現(xiàn)在209.6 nm,次大吸收峰為255.4 nm,對(duì)照品的最大吸收峰和次大吸收峰分別為217.1和252.1 nm。比對(duì)結(jié)果說明,樣品中的兩個(gè)未知峰均不是目標(biāo)物質(zhì)五味子醇甲。

圖 5 五味子醇甲對(duì)照品和樣品中未知組分光譜疊加圖Fig. 5 Stacked spectrograms of the schisandrin reference and the unknown components in sample

為了進(jìn)一步驗(yàn)證,在樣品中按1∶1的體積比添加對(duì)照品,使用疏水性更強(qiáng)的SinoChrom ODS-BP色譜柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm),調(diào)整流動(dòng)相比例,增加甲醇含量至60% ,進(jìn)行分析,結(jié)果見圖6。對(duì)照品的出峰時(shí)間延長至14.58 min,加標(biāo)樣品中五味子醇甲的峰面積與對(duì)照品的峰面積之比為1∶2。樣品中的兩個(gè)未知組分保留時(shí)間分別為13.58和16.14 min,實(shí)現(xiàn)了基線分離。提取加標(biāo)樣品譜圖中3個(gè)色譜峰的光譜圖,結(jié)果與圖5中對(duì)照品、兩個(gè)未知組分一致,確認(rèn)未知峰不是五味子醇甲。

圖 6 五味子醇甲對(duì)照品和棗仁天麻膠囊加標(biāo)樣品的疊加譜圖Fig. 6 Stacked chromatograms of the schisandrin reference and spiked Jujube kernel Tianma capsule sample

3 結(jié)論

經(jīng)典的液相色譜分析方法采用保留時(shí)間作為定性的主要依據(jù)。本文所列舉的兩個(gè)實(shí)例(蒲黃中的金胺O和棗仁天麻膠囊中的五味子醇甲)在常規(guī)分析中,目標(biāo)物出峰位置都有未知組分峰出現(xiàn)。如果單以保留時(shí)間為依據(jù),均會(huì)出現(xiàn)假陽性的結(jié)果,會(huì)將質(zhì)量良好的蒲黃錯(cuò)誤地認(rèn)為加入了非法添加劑、將不含五味子醇甲的棗仁天麻膠囊錯(cuò)誤地定為優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。因此,利用保留時(shí)間/吸收光譜雙定性原則可以快捷地辨識(shí)保留時(shí)間相似的雜質(zhì)峰,微調(diào)分析條件可以獲得更理想的分離效果,為中藥組分研究提供了普適性的參考方法。