何嘉雯, 溫家欣, 賴宇紅, 曹雅靜

(廣東省藥品檢驗所, 廣東 廣州 510180)

草本植物飲料憑借著去火排毒的宣傳,以功能性飲料的姿態(tài)成為飲料市場中的新寵,人們熟知的有涼茶、板藍根飲料等[1]。隨著草本植物飲料的興起,涼茶作為重要代表再次在市場上火起來。然而在激烈的市場競爭中,不法商家在涼茶中非法添加化學(xué)藥物,以求達到其宣稱的降火功效,埋下了嚴(yán)重的安全隱患。這種違法行為并不是個別行為,已漸漸演變成行業(yè)潛規(guī)則,嚴(yán)重影響草本飲料產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展,擾亂市場秩序。

目前,針對草本植物飲料非法添加的研究較少[2-9]。具有解熱、消炎藥理作用的藥物均有被非法添加的可能,目前發(fā)現(xiàn)的藥物有非甾體解熱鎮(zhèn)痛藥、激素、抗菌藥、中樞興奮劑等[10-14],種類繁雜。謝文輝等[3]和謝集照等[4]采用TLC、劉輝等[5]采用酶聯(lián)免疫法,建立了對乙酰氨基酚的快篩方法。溫家欣等[6]采用HPLC快速測定涼茶中11種非法添加化學(xué)藥物。宋寧寧等[7]建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS測定涼茶中12種化學(xué)藥物。韓婉清等[8]采用SPE-UPLC-MS/MS測定涼茶中15種植物源性興奮劑和外源性藥物。通過QuEChERS、SPE凈化手段去除基質(zhì)干擾,使液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法獲得較好的結(jié)果。然而,本研究組在大批量實際樣品檢測過程中發(fā)現(xiàn),液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法凈化手段雖能減少基質(zhì)污染,但涼茶中外源性藥物過高的濃度造成的自身污染仍難以避免,使得儀器污染后出現(xiàn)大量假陽性,影響實驗重復(fù)性。雖然稀釋樣品能改善污染情況,但由于不同藥物間添加量的極大差異和非法添加的未知性,稀釋容易造成漏檢。而且目前研究集中在液體涼茶,沒有涵蓋顆粒劑、涼茶粉、代用茶等新劑型。本文以添加風(fēng)險較高的28種成分作為研究對象,選擇抗污染能力強、重復(fù)性好的高效液相色譜法,建立一套準(zhǔn)確性好、耐用性高的檢測方法,為草本植物飲料的監(jiān)督檢驗提供助力。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器(美國Waters公司); Thermo Accucore C18色譜柱(100 mm×4.6 mm, 2.6 μm,美國Thermo公司); Sartorius MS205DU電子天平(德國Sartorius公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥98% ,其中對乙酰氨基酚(paracetamol)、水楊酸(salicylic acid)、咖啡因(caffeine)、安乃近(dipyrone)、4-甲氨基安替比林(4-methylaminoantipyrine)、甲氧芐啶(trimethoprim)、氨基比林(antipyrine)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、非那西丁(phenacetin)、潑尼松(prednisone)、氫化可的松(hydrocortisone)、吡羅昔康(piroxicam)、異丙安替比林(propyphenazon)、地塞米松(dexamethasone)、舒林酸(sulindac)、酮洛芬(ketoprofen)、萘普生(naproxen)、醋酸潑尼松(prednisone acetate)、芬布芬(fenbufen)、醋酸地塞米松(dexamethasone acetate)、奧沙普秦(oxaprozin)、萘丁美酮(nabumetone)、雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)、保泰松(phenylbutazone)、吲哚美辛(indometacin)、布洛芬(ibuprofen)和阿司匹林(aspirin)均購自中國食品藥品檢定研究院;甲基潑尼松龍(methylprednisolone)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。甲醇和乙腈(均為色譜純)購自美國Holly公司,乙酸銨和冰醋酸(均為分析純)購自廣州化學(xué)試劑廠,實驗用水為超純水。

草本飲料樣品收集于2016年～2017年風(fēng)險監(jiān)測任務(wù),范圍涵蓋廣東全省,包含預(yù)包裝產(chǎn)品和現(xiàn)場制售涼茶,共456批次。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液:除阿司匹林外,分別準(zhǔn)確稱取各成分標(biāo)準(zhǔn)品0.02 g,用甲醇溶解并配制2 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。吡羅昔康難溶,可用冰醋酸助溶。阿司匹林采用甲醇-冰醋酸(99∶1, v/v)配制。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用甲醇-水(70∶30, v/v)稀釋,混勻,配制成質(zhì)量濃度為50 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。定量時,阿司匹林需用甲醇-冰醋酸(99∶1, v/v)單獨配制。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇-水(70∶30, v/v)配制成1～50 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。必要時,可按實際需要,采用分組方式配制質(zhì)量濃度范圍更廣的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

液體樣品:搖勻,稱取5.0 g試樣,加甲醇-水(70∶30, v/v)適量。超聲提取15 min,放冷,定容至25 mL,搖勻,提取液過0.22 μm濾膜,待測。固體飲料、代用茶和顆粒:樣品先用研磨機充分粉碎或用研缽研細,稱取0.5 g試樣,加甲醇-水(70∶30, v/v)適量,超聲提取30 min,放冷,定容至50 mL,搖勻,提取液過0.22 μm濾膜,待測。若樣品中待測成分濃度超出線性范圍,用甲醇-水(70∶30, v/v)適當(dāng)稀釋。

1.4 分析條件

色譜柱:Thermo Accucore C18色譜柱(100 mm×4.6 mm, 2.6 μm);流速為1.2 mL/min;柱溫為35 ℃;進樣量為5 μL;檢測波長為254和220 nm。流動相:A為甲醇,B為乙腈,C為20 mmol/L乙酸銨溶液(pH 4.2,冰醋酸調(diào))。梯度洗脫條件:0～3 min, 3%A～6%A, 6%B～12%B, 91%C～82%C; 3～4 min, 6%A～8%A, 12%B～15%B, 82%C～77%C; 4～9 min, 8%A～12%A, 15%B～23%B, 77%C～65%C; 9～12 min, 12%A, 23%B, 65%C; 12～24 min, 12%A～20%A, 23%B～38%B, 65%C～42%C; 24～25 min, 20%A～3%A, 38%B～6%B, 42%C～91%C; 25～30 min, 3%A, 6%B, 91%C。

1.5 計算公式

除阿司匹林外,27種成分計算公式為:

(1)

其中X為草本植物飲料中化學(xué)成分的含量(mg/kg),C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的質(zhì)量濃度(mg/L),V為稀釋體積(mL),m為試樣取樣量(g)。

阿司匹林在溶液中易水解,計算時需對降解產(chǎn)物水楊酸進行折算,計算公式為:

(2)

其中asp.表示阿司匹林,s.a.表示水楊酸。僅檢出水楊酸時,視為阿司匹林未檢出,不進行折算。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇

核殼填料能減少分析物在色譜柱中的渦流擴散,從而獲得較好的分離效率,縮短分析時間,實現(xiàn)快速分離[15]。考察了不同品牌和不同填料的C18核殼色譜柱的分離效果,包括Thermo Accucore C18(100 mm×4.6 mm, 2.6 μm)、Thermo Accucore aQ(100 mm×4.6 mm, 2.6 μm)、Thermo Accucore RP-MS(100 mm×4.6 mm, 2.6 μm)、Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm×4.6 mm, 2.7 μm)和ACE UltraCore SuperC18(100 mm×4.6 mm, 2.5 μm)。圖1為分別使用5種色譜柱的分離情況比較。Thermo Accucore C18、Thermo Accucore aQ和Thermo Accucore RP-MS為同品牌的不同C18填料色譜柱,在相同的色譜條件下保留行為基本相似,Thermo Accucore C18能基本分離28種成分,但Thermo Accucore aQ在5～10 min、Thermo Accucore RP-MS在20～25 min分離效果不理想。Agilent Poroshell 120 EC-C18除氫化可的松和吡羅昔康分離較差、保泰松和吲哚美辛重合外,其余24種成分分離良好。ACE UltraCore SuperC18除萘丁美酮和雙氯芬酸鈉分離較差外,其余26種成分能基本分離。綜上,選擇Thermo Accucore C18作為分析柱。

圖 1 使用不同色譜柱時28種成分的分離色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the 28 components separated on different columns a. Thermo Accucore C18 (100 mm×4.6 mm, 2.6 μm); b. Thermo Accucore aQ (100 mm×4.6 mm, 2.6 μm); c. Thermo Accucore RP-MS (100 mm×4.6 mm, 2.6 μm); d. Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100 mm×4.6 mm, 2.7μm); e. ACE UltraCore SuperC18 (100 mm×4.6 mm, 2.5 μm). Peak Nos: 1. paracetamol; 2. salicylic acid; 3. caffeine; 4. aspirin; 5. dipyrone; 6. trimethoprim; 7. antipyrine; 8. 4-methylaminoantipyrine; 9. sulfamethoxazole; 10. phenacetin; 11. prednisone; 12. hydrocortisone; 13. piroxicam; 14. propyphenazon; 15. methylprednisolone; 16. dexamethasone; 17. sulindac; 18. ketoprofen; 19. naproxen; 20. prednisone acetate; 21. fenbufen; 22. dexamethasone acetate; 23. oxaprozin; 24. nabumetone; 25. diclofenac sodium; 26. phenylbutazone; 27. indometacin; 28. ibuprofen.

2.1.2緩沖鹽pH值的優(yōu)化

由于28種成分結(jié)構(gòu)各異,緩沖鹽pH值的變動對酸堿物質(zhì)的保留行為有較大影響,可能改變出峰順序。考察pH 4～pH 5之間各成分的保留行為。隨著pH值降低,保泰松、吡羅昔康、阿司匹林、舒林酸、酮洛芬、萘普生、芬布芬、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、布洛芬的保留時間增加,氨基比林、4-甲氨基安替比林的保留時間減少,其余成分的保留時間變化不大。當(dāng)緩沖鹽pH值為4.2時,分離效果最佳。

2.1.3光譜特征和檢測波長的選擇

阿司匹林、水楊酸、布洛芬在220 nm下有較強吸收。但受梯度影響,在220 nm下的色譜基線波動較大,阿司匹林、水楊酸的積分效果較差。其他成分最大吸收波長分布在240～290 nm之間,在254 nm下均有良好的響應(yīng)。綜合考慮,選取254 nm作為主要檢測波長,220 nm作為布洛芬的輔助檢測波長。

2.2 前處理的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的選擇

28種成分均能溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑,綜合考慮液相色譜的適用性,提取溶劑考察以甲醇、乙腈為主。對于固體樣品,考察了水、甲醇-水(70∶30, v/v)、甲醇、甲醇-乙腈(50∶50, v/v)的提取效果。部分成分在水中溶解度較差,回收率不理想;有機試劑提取效果佳,但提取液有較強的溶劑效應(yīng),峰形差。甲醇-水(70∶30, v/v)作提取溶劑時回收率達92%以上,同時避免高有機溶劑比例帶來溶劑效應(yīng),令人滿意。部分液體樣品沉淀較多或過于濃稠,直接過濾干擾非常大。同法考察液體樣品的提取溶劑,結(jié)果與固體樣品類似,甲醇-水(70∶30, v/v)作提取溶劑時回收率達88%以上。因此選擇甲醇-水(70∶30, v/v)作為提取溶劑。

2.2.2易降解成分的穩(wěn)定性考察

阿司匹林、安乃近在溶液中穩(wěn)定性較差,對其穩(wěn)定性進行考察。阿司匹林的降解物主要為水楊酸,安乃近的降解物主要為4-甲氨基安替比林,其降解程度與溶劑和基質(zhì)有關(guān)。在甲醇-水(70∶30, v/v)中,阿司匹林24 h內(nèi)降解64% ,安乃近24 h內(nèi)降解9% 。將空白樣品按1.3節(jié)方法進行前處理,制得空白樣品溶液,在該溶液中阿司匹林24 h內(nèi)降解90% ,安乃近24 h內(nèi)降解10% 。在甲醇-冰醋酸(99∶1, v/v)中,阿司匹林24 h內(nèi)幾乎不降解。因此,阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)溶液采用甲醇-冰醋酸(99∶1, v/v)配制,現(xiàn)配現(xiàn)用。當(dāng)計算阿司匹林含量時,將降解的水楊酸進行折算,更為合理。本實驗標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液配制后應(yīng)在24 h內(nèi)完成分析。

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1線性范圍與檢出限

除阿司匹林外,準(zhǔn)確吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇-水(70∶30, v/v)配制質(zhì)量濃度為1、5、10、25、40和50 mg/L的系列溶液。阿司匹林采用甲醇-冰醋酸(99∶1, v/v)配制,質(zhì)量濃度為5、10、25、40、50和100 mg/L。以峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x, mg/L)進行線性回歸,結(jié)果表明各成分呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999(見表1)。

當(dāng)濃度接近檢出限時,應(yīng)考慮樣品基質(zhì)的干擾,配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液以確定檢出限(LOD)。將空白液體樣品和固體飲料樣品按1.3節(jié)方法進行前處理,制得溶液作為檢出限溶液稀釋溶劑,以3倍信噪比(S/N=3)的結(jié)果作為檢出限。結(jié)果表明,液體樣品和固體樣品中成分的檢出限分別為1～10 mg/kg和20～200 mg/kg(見表1)。

表 1 28種成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、線性范圍與檢出限Table 1 Linear equations, correlation coefficients (r), linear ranges and limits of detection (LODs) of the 28 components

y: peak area;x: mass concentration, mg/L.

2.3.2回收率與精密度

按照1.3節(jié)樣品前處理方法向空白基質(zhì)中分別加入低、中、高3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行加標(biāo)回收率的測定。結(jié)果(見表2)表明,液體樣品中28種成分的加標(biāo)回收率為88.8% ～118.6% , RSD為0.1% ～6.7% ;固體樣品中的平均加標(biāo)回收率為92.7% ～112.3% , RSD為0.1% ～6.4% 。

2.4 實際樣品檢測

2.4.1檢測結(jié)果

應(yīng)用建立的方法對456批次樣品進行分析,陽性樣品代表色譜圖見圖2。結(jié)果表明,55批次樣品中檢出目標(biāo)成分,檢出率為12.1% 。檢出成分包括對乙酰氨基酚、阿司匹林、咖啡因、非那西丁等。對乙酰氨基酚檢出批次最多,共48批次。普遍存在組合添加的情況,具體結(jié)果見表3。

圖 2 陽性樣品色譜圖Fig. 2 Chromatogram of the positive sample Peak Nos: 1. paracetamol; 9. sulfamethoxazole; 20. prednisone acetate.

2.4.2檢測結(jié)果分析

統(tǒng)計實驗結(jié)果可知,不同種類成分的添加量是不同的,可基本分為兩級濃度水平。第一級是以對乙酰氨基酚為代表的解熱鎮(zhèn)痛藥,添加范圍為50～4 500 mg/kg(液體樣品)和1.0×104～4.5×105mg/kg(固體樣品),其特點是濃度較高、跨度較大、個別成分添加量極高。第二級為以醋酸潑尼松為代表的糖皮質(zhì)激素,添加范圍為8～20 mg/kg(液體樣品)和6.0×102～6.0×103mg/kg(固體樣品)。這種非法添加特點與藥物治療劑量相關(guān)。當(dāng)兩種濃度水平成分被同時添加于同一樣品時,需選擇合適的稀釋倍數(shù),避免峰過載或低含量成分漏檢。另外,部分第一級成分也存在低濃度檢出的情況,可能是非法添加現(xiàn)場加工器皿不潔造成的。

表 2 液體樣品和固體樣品中28種成分的加標(biāo)回收率及RSD(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSDs of the 28 components in the liquid and solid samples (n=6)

表 2 (續(xù))Table 2 (Continued)

表 3 陽性成分的檢出數(shù)量和檢出含量范圍Table 3 Detected amounts and detected content ranges of the positive compounds

/: not detected.

2.4.3植物內(nèi)源性成分的判定

草本植物飲料原料多為藥食同源的中藥材,經(jīng)煎制后成品的具體組分尚未明確。水楊酸為植物內(nèi)源性激素,存在于柳樹皮、煙草、黃瓜等植物中。456批樣品中,沒有單獨檢出水楊酸,1批樣品中檢出水楊酸和阿司匹林。經(jīng)討論,阿司匹林在水中易水解得到水楊酸,若兩者同時檢出,檢出的水楊酸很有可能是由阿司匹林產(chǎn)生的。單獨檢測水楊酸意義不大,當(dāng)只檢出水楊酸時,不應(yīng)將其折算為阿司匹林。本實驗水楊酸檢測的目的是輔助阿司匹林含量計算。

咖啡因是一種植物生物堿,存在于咖啡、茶及一些可可中,可作為食品添加劑用于可樂型碳酸飲料。然而,咖啡因也是一種中樞神經(jīng)興奮劑,可加強其他解熱鎮(zhèn)痛藥物的療效,是較常用的感冒藥處方。456批涼茶中,有3批單獨檢出咖啡因,均為預(yù)包裝產(chǎn)品;有4批同時檢出咖啡因與其他解熱鎮(zhèn)痛藥,為現(xiàn)場制售涼茶或涼茶粉。在預(yù)包裝產(chǎn)品中單獨檢出咖啡因時,可參考其標(biāo)簽上的食品添加劑信息和食品分類,判斷是否非法添加。若咖啡因與外源性藥物同時檢出,則有作為感冒藥被加入的可能,其檢出可以作為非法添加行為的一種提示。水楊酸、咖啡因的檢出不代表非法添加行為的存在,應(yīng)綜合考慮各種因素,根據(jù)實際情況加以判定。

3 結(jié)論

本文考慮到草本飲料中非法添加藥物的濃度水平和差異性,結(jié)合實際工作中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法出現(xiàn)假陽性的問題,建立了快速測定草本植物飲料中28種外源性藥物和內(nèi)源性成分的HPLC分析方法。該法優(yōu)化了柱體系、流動相體系、提取溶劑等參數(shù),并對易降解成分的計算、內(nèi)源性成分的判定等進行討論,操作簡便,重復(fù)性高,可為草本植物飲料中非法添加藥物的監(jiān)督檢驗提供有力的技術(shù)支撐。