商瑋 徐子涵 郭郡浩 董曉蕾 趙智明 蔡輝

解放軍南京總醫(yī)院中西醫(yī)結合科，江蘇 南京 210002

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以慢性滑膜炎和骨破壞為特征的自身免疫性疾病[1]。關節(jié)周圍骨侵蝕主要發(fā)生于滑膜與軟骨交界處，可導致關節(jié)間隙狹窄，從而發(fā)生不同程度的關節(jié)僵硬、畸形，造成RA患者功能障礙和殘疾。破骨細胞(osteoclast，OC)在這一病理過程中起關鍵作用，研究表明RA患者OC活性增加可加重全身性骨丟失[2]?；罨疶細胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1，NFATc1)是促進OC分化的關鍵調節(jié)因子，核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)通過核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)/AP-1/c-fos和鈣離子信號通路兩條信號通路調節(jié)NFATc1的活化，促進OC分化[3]。

姜黃素(curcumin，Cur)是從中藥姜黃中提取的一種低分子量的酚類物質，具有抗炎、抗氧化和抗癌活性[4]，已有研究發(fā)現(xiàn)Cur能改善RA患者疾病活動度[5]。本課題前期發(fā)現(xiàn)Cur能調節(jié)RANKL/OPG比值，提高佐劑性關節(jié)炎大鼠骨密度水平[6]，但其具體作用機制尚不明確。本研究通過應用Cur干預RA患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，檢測其對OC生成及NF-κB p65、NFATc1蛋白表達的影響，探討Cur影響RA患者OC生成的可能機制。

1 材料和方法

1.1 研究對象

血液標本來源：確診活動期RA患者12例，年齡(56.3±15.1)歲，RA診斷均符合2010年RA的ACR/EULAR分類標準[7]，所有患者均簽署知情同意書，并經(jīng)過我院倫理委員會批準。

1.2 材料

NF-κB p65、NFATc1多克隆抗體(Cell Signaling Technology公司，美國)，RANKL、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)(Pepro Tech公司，美國)，α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(杭州四季青生物工程材料有限公司，中國)，人淋巴細胞分離液(Sigma公司，美國)，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色試劑盒(南京建成科技有限公司，中國)，姜黃素標準品(批號：FY13561019，南通飛宇生物科技有限公司，中國)。

1.3 方法

1.3.1RA-OC原代培養(yǎng)及鑒定：采用密度梯度離心法分離RA患者PBMC，以2×106個/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿中[8]，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內孵育2～3 h，吸除皿內培養(yǎng)液以去除懸浮細胞，將貼壁細胞用胰酶消化，將細胞調節(jié)成2×105個/cm2接種于24孔板中，用含100 ng/mL RANKL、50 ng/mL M-CSF及20% FBS的α-MEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，2～3 d換液一次。細胞形態(tài)學觀察、TRAP染色及骨吸收試驗對RA-OC進行鑒定。

1.3.2Cur細胞毒性檢測：取96孔板，各孔加入100 μL的PBMC細胞懸液(5×105/mL)，37 ℃孵育過夜，加入含Cur培養(yǎng)基，濃度為0、2.5、5和10 μmol/L，每組3個復孔，分別孵育24、48 和72 h，加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，于450 nm 波長處測吸光度，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.3TRAP染色檢測Cur對RA-OC分化的影響：RA患者PBMC在含100 ng/mL RANKL、50 ng/mL M-CSF、20% FBS及不同濃度Cur(0、2.5、5和10 μmol/L)的α-MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，2～3 d換液。14 d后，參照TRAP染色試劑盒說明書進行TRAP染色，光鏡下觀察染色結果，并隨機選取10個視野，計數(shù)TRAP陽性細胞(細胞核≥3個，胞質呈酒紅色)，結果用“個/10個視野”表示，每孔重復計數(shù)3次。

1.3.4NF-κB p65蛋白表達的檢測：Western-blotting檢測：細胞培養(yǎng)14 d后，用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒提取核蛋白和胞漿蛋白，進行蛋白定量，100 ℃變性3～5 min，上樣后進行蛋白電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，NF-κB p65一抗(1∶1000稀釋)4 ℃孵育過夜(胞漿蛋白以β-Actin為內參，核蛋白以Lamin B1為內參)，二抗(1∶2000稀釋)室溫振蕩孵育2 h，滴加ECL試劑于X線下曝光顯影，計算各條帶的灰度值，結果以目的蛋白與內參蛋白灰度值之比來表示。免疫熒光染色檢測：將分離獲得的PBMC接種于24孔板內無菌蓋玻片上，設陰性對照組(M-CSF+/RANKL-)、陽性對照組(M-CSF+/RANKL+)、Cur 5 μmol/L組(M-CSF+/RANKL+/Cur 5 μmol/L)，按分組加入含有細胞因子和干預藥物的培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d后4%多聚甲醛固定，0.5% Triton透化15 min，1% BSA室溫封閉30 min， 5% BSA稀釋的NF-κB p65多克隆一抗(1∶50)，4 ℃孵育過夜，5% BSA稀釋的TRITC標記的羊抗兔IgG(1∶200)，37 ℃避光孵育1 h，5 μg/mL DAPI避光孵育5 min，封片固定，于熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖片。

1.3.5NFATc1蛋白表達的檢測：Western-blotting檢測：細胞培養(yǎng)14 d后，提取細胞總蛋白，進行蛋白定量， 100 ℃變性3～5 min，上樣后進行蛋白電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，NFATc1一抗4 ℃孵育過夜，以β-Actin為內參，二抗室溫振蕩孵育2 h，滴加ECL試劑于X線下曝光顯影，計算各條帶的灰度值，結果以目的蛋白與內參蛋白灰度值之比來表示。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 RA-OC的原代培養(yǎng)及鑒定

形態(tài)學觀察：培養(yǎng)至第14天，胞體明顯增大，可見多個多核細胞，折光性強，形態(tài)呈類圓形和不規(guī)則形，可見片狀偽足和絲狀突起，胞內有3～5以上的細胞核，胞漿內可見大小不等的空泡，符合OC形態(tài)特征。(圖1 A)

TRAP染色：200×光鏡下可見形態(tài)不規(guī)則、體積較大的多核細胞。胞漿見散在的紫紅色顆粒樣沉淀，顏色較深。蘇木精復染后，細胞核呈藍紫色，胞核3～5個以上不等，符合TRAP染色陽性特征。(圖1B)

骨吸收陷窩檢測：取與細胞共培養(yǎng)21 d的骨磨片，在光鏡下觀察可見骨表面有大小不等，深淺不一，不規(guī)則橢圓形的骨吸收陷窩，邊緣清晰。甲苯胺藍染色后，骨吸收陷窩呈藍紫色異染(圖1C)。掃描電鏡下觀察，可見陷窩底部具有因骨膠原纖維殘留而顯粗糙的骨吸收特征。(圖1D)

圖1 RA-OC的鑒定A. 細胞形態(tài)學觀察(200×)B. TRAP染色(200×)C. 倒置顯微鏡下骨吸收陷窩(200×)D. 掃描電鏡下骨吸收陷窩(1000×)Fig.1 Identification of osteoclasts from RA patientsA. Observation of cell morphology (200×). B. TRAP staining (200×). C. Bone resorption lacunae observed by inverted microscope (200×). D. Bone resorption lacunae observed by scanning electron microscope (1000×).

2.2 Cur對細胞存活率的影響

CCK-8檢測結果顯示，培養(yǎng)24、48 和72 h，各濃度組與對照組相比，對PBMC細胞存活率無明顯影響(P>0.05)(圖2)，說明Cur 2.5、5和10 μmol/L的濃度對PBMC未產生細胞毒性。

圖2 Cur對細胞存活率的影響Fig.2 The effect of curcumin on cell viability

2.3 Cur對RA-OC分化的影響

200×光鏡下見，Control組為正常OC，細胞形態(tài)均一、分布均勻、輪廓清晰，有3～5個以上細胞核(圖3 A)。經(jīng)不同濃度Cur干預后，視野內OC數(shù)量明顯減少，形態(tài)各異，大部分為未分化成熟的破骨細胞前體細胞(osteoclast precursor，OCP)(圖3 B、3C、3D)。TRAP+細胞計數(shù)結果顯示，與Control組比較，Cur 2.5 μmol/L組、Cur 5 μmol/L組和Cur 10 μmol/L組TRAP+細胞數(shù)均明顯減少(P<0.05),說明Cur對RA-OC分化具有抑制作用。(圖4)

圖3 TRAP染色(200×)A. Control組；B. Cur 2.5 μmol/L 組；C. Cur 5 μmol/L 組；D. Cur 10 μmol/L 組Fig.3 TRAP staining(200×)A. Control Group；B. Cur 2.5 μmol/L Group；C. Cur 5 μmol/L Group；D. Cur 10 μmol/L Group

2.4 Cur對RA-OC NF-κB p65表達的影響

分別提取各組細胞的細胞漿蛋白和細胞核蛋白，通過Western-blotting檢測NF-κB p65在細胞漿和細胞核中的表達，觀察NF-κB p65入核表達情況。結果顯示，與Control組相比，Cur 2.5 μmol/L組、Cur 5 μmol/L組和Cur 10 μmol/L組細胞漿中NF-κB p65的蛋白表達明顯升高，而細胞核中NF-κB p65的蛋白表達明顯下降(P<0.05)，提示Cur具有抑制NF-κB p65入核表達的作用，并且隨著干預濃度的增加，抑制NF-κB p65入核表達的作用更加明顯。(圖5)

圖5 Cur對RA-OC細胞漿和細胞核中NF-κB p65表達的影響注：* P<0.05Fig.5 The effect of curcumin on the expression of NF-κB p65 in cytoplasm and nucleus of osteoclasts of RA patientsNote: * P<0.05

圖4 Cur對RA-OC分化的影響注：* P<0.05Fig.4 The effect of curcumin on osteoclast differentiation in RA patientsNote:* P<0.05

通過細胞免疫熒光染色法觀察Cur對RA-OC NF-κB p65核易位的影響。由圖6我們觀察到，陰性對照組NF-κB p65主要分布于細胞漿中；RANKL干預后，NF-κB p65在細胞漿的表達減少，在細胞核的表達增加；5 μmol/L Cur干預后，與陽性對照組相比，NF-κB p65在細胞漿的表達增加，在細胞核的表達減少, 提示Cur具有抑制RA-OC NF-κB p65核易位的作用。

2.5 Cur對RA-OC NFATc1表達的影響

Western-blotting檢測NFATc1蛋白的表達，結果顯示，Cur 2.5 μmol/L組、Cur 5 μmol/L組和Cur 10 μmol/L組細胞中NFATc1蛋白表達水平均低于Control組(P<0.05)，提示Cur顯著抑制RA-OC NFATc1蛋白的表達。(圖7)

3 討論

圖6 免疫熒光檢測NF-κB p65在RA-OC中的表達Fig.6 Detection of NF-κB p65 expression in osteoclasts of RA patients by immunofluorescence staining

圖7 Cur對RA-OC NFATc1表達的影響注：* P<0.05Fig.7 The effect of curcumin on the expression of NFATc1 in osteoclasts of RA patientsNote:* P<0.05

滑膜炎導致的關節(jié)軟骨和骨的破壞是RA病理變化的中心環(huán)節(jié)，是患者發(fā)生關節(jié)變形和殘疾的主要原因。RA關節(jié)局部的成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synovial cells，F(xiàn)LS)釋放大量的炎癥介質，形成局部炎癥環(huán)境[3]，分泌RANKL與OCP表面上的 RANK 結合后，通過NF-κB/AP-1/c-fos和鈣離子信號兩條信號通路，調節(jié)NFATc1的活化，促進OC分化[9]。NFATc1是OC分化的關鍵轉錄因子，NFATc1被激活后可轉錄出OC特異性基因如TRAP、組織蛋白酶K、基質金屬蛋白酶-9[10]。

Cur是從姜黃中獲得的四萜類化合物，具有抗炎、抗氧化和抗癌活性[4]。在本課題組前期研究工作[6,11,12]基礎上，本實驗進一步探索Cur在治療RA骨破壞中的作用及其可能機制，通過體外誘導RA患者PBMC分化為OC，經(jīng)形態(tài)學觀察、TRAP染色、骨吸收陷窩實驗對OC進行鑒定，結果顯示本實驗中使用的外周血單核細胞誘導法能成功獲得分化成熟且具有骨吸收功能的OC。選用對細胞存活率無明顯影響的濃度2.5、5和10 μmol/L作為本實驗Cur干預濃度，在實驗中觀察到Cur具有抑制RA-OC分化的作用。

OC的分化涉及數(shù)條通路，其中NF-κB/NFATc1信號通路是OC分化中的重要信號途徑之一[13]。NF-κB轉錄因子在細胞因子、病原體和輻射等刺激的影響下被快速的激活。p65是NF-κB核轉錄因子的核心亞基，轉入到細胞核后，驅動靶基因的表達而發(fā)揮功能[14]。本實驗分別提取細胞漿蛋白和細胞核蛋白，檢測NF-κB p65在細胞漿和細胞核中的表達，結果提示Cur具有抑制NF-κB p65入核表達的作用。免疫熒光結果與Western-blotting結果與相一致，分別從NF-κB p65的定量及定位表達說明Cur具有抑制RA-OC NF-κB p65核易位的作用。Bharti等[15]研究發(fā)現(xiàn)Cur能抑制RAW264.7 OC形成，與抑制NF-κB的活化有關，本研究的結果與其研究結果相符合。

NFATc1是重要轉錄調節(jié)因子，參與OC特異性基因的調控表達，對OC分化、融合、粘附及骨吸收功能至關重要[16]。本研究通過Western-blotting檢測各組NFATc1蛋白的表達，結果提示Cur抑制NFATc1在RA-OC中的表達。OCP的RANK活化后，激活多條途徑誘導NFATc1的活化，而NFATc1是NF-κB信號的靶基因。因而，Cur導致的NFATc1表達的抑制，可能與其對NF-κB活化的抑制有關，同時，NFATc1表達的抑制，影響了RA-OC的分化與成熟。

綜上，Cur能抑制RA-OC分化過程中的NF-κB信號，抑制NF-κB p65的入核表達，降低轉錄因子NFATc1的表達，從而抑制RA-OC的分化。本研究進一步闡明Cur改善RA骨破壞的作用機制，為開發(fā)Cur相關藥物應用于RA治療提供了實驗依據(jù)。