白玉彬，董 朕，張吉麗，周緒正，張繼瑜

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050）

五氯柳胺（Oxyclozanide）屬于水楊苯胺類藥物，是一種氧化磷酸化解偶聯(lián)劑，可降低寄生蟲體內(nèi)三磷酸腺甙（ATP）的合成量，從而導(dǎo)致蟲體因能量代謝紊亂而最終死亡［1］，該藥對(duì)吸蟲、絳蟲和線蟲均具有活性。為滿足獸醫(yī)臨床的需求，本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)了五氯柳胺口服混懸劑，采用焦亞硫酸鈉作為五氯柳胺混懸液的抗氧化劑，以提高制劑的穩(wěn)定性［2－5］。在溶液中焦亞硫酸鈉會(huì)產(chǎn)生二氧化硫，從而生成亞硫酸鹽對(duì)動(dòng)物造成損害，控制焦亞硫酸鈉的含量對(duì)提高產(chǎn)品的安全性具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent cary 100 UV－Vis （Agilent Technologies）；KQ－600DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UPT－Ⅱ－40L優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)（上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司）；賽多利斯SQP電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］。

1.2 試劑

無(wú)水亞硫酸鈉 （天津市濱?？频匣瘜W(xué)試劑有限公司）；酸性品紅（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；冰乙酸（天津恒興試劑）；結(jié)晶乙酸鈉（天津市北辰方正試劑廠）；乙二胺四乙酸二鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；五氯柳胺混懸液（實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)20171102、20171103、20171104）。

1.3 溶液配置

1.3.1 酸性品紅溶液的配制 精密稱量酸性品紅0.34 g，加入1 mL硫酸，加水稀釋并定容至1 000 mL。

1.3.2 醋酸鹽緩沖液（pH=4.8）的配制 稱取結(jié)晶乙酸鈉 136.1 g，乙二胺四乙酸二鈉 0.4 g，加入冰乙酸57 mL。加水溶解并定容至1 000 mL。

1.3.3 0.04%乙二胺四乙酸二鈉溶液的配制 精密稱量乙二胺四乙酸二鈉0.4 g，加水溶解并定容至1 000 mL。

1.3.4 無(wú)水亞硫酸鈉對(duì)照品溶液的配制 精密稱量無(wú)水亞硫酸鈉10 mg，加入0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液稀釋并定容至50 mL，配制成200 μg/mL作為儲(chǔ)備溶液。精密量取儲(chǔ)備溶液適量，依次使用0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液稀釋為100、80、60、50、40、30、20 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

1.3.5 供試品溶液的配制 精密量取1 mL五氯柳胺混懸液于100 mL容量瓶中，加入適量0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液，超聲溶解，加0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液定容至100 mL。

1.3.6 輔料干擾溶液的配制 精密量取1 mL不含焦亞硫酸鈉的五氯柳胺混懸液于100 mL容量瓶中，加入適量0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液，超聲溶解，并定容至100 mL。

1.4 測(cè)定方法的建立

1.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 精密量取酸性品紅溶液2mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸鹽緩沖液，共4份，分別加入醋酸鹽緩沖液1 mL（空白溶液）、輔料干擾溶液1 mL、50 μg/mL無(wú)水亞硫酸鈉對(duì)照品溶液1 mL、供試品溶液1 mL，加醋酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻。以醋酸鹽緩沖液為參比，在200～800 nm進(jìn)行掃描。

1.4.2 反應(yīng)時(shí)間的選擇 精密量取酸性品紅溶液2mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸鹽緩沖液，加入50 μg/mL無(wú)水亞硫酸鈉對(duì)照品溶液1 mL，加醋酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻。室溫下放置5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60 min， 測(cè)定上述溶液在548 nm處的吸光度，選擇吸光度穩(wěn)定的時(shí)間作為反應(yīng)時(shí)間。

1.4.3 專屬性試驗(yàn) 精密量取酸性品紅溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸鹽緩沖液，共2份，分別加入醋酸鹽緩沖液1 mL（空白溶液）和輔料干擾溶液1 mL，加醋酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻。室溫下放置45 min，分別在548 nm處測(cè)定吸光度。測(cè)得空白溶液和輔料干擾溶液的吸光度，觀察輔料是否會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取酸性品紅溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸鹽緩沖液，共7份，分別加入 100、80、60、50、40、30、20 μg/mL 的對(duì)照品溶液，加醋酸鹽緩沖液定容，搖勻，室溫下放置45 min。以醋酸鹽緩沖液作為參比，測(cè)定上述溶液在548 nm處的吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取酸性品紅溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸鹽緩沖液，共6份，分別加入供試品溶液，加醋酸鹽緩沖液定容，搖勻，室溫下放置45 min。以醋酸鹽緩沖液作為參比，測(cè)定上述溶液在548 nm處的吸光度。計(jì)算RSD，RSD不得大于2%。

1.4.6 回收率試驗(yàn) 精密稱取4、5、6 mg無(wú)水亞硫酸鈉于100 mL容量瓶中，加入0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液定容，搖勻，配制成 40、50、60 μg/mL 的對(duì)照品溶液。精密量取酸性品紅溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸鹽緩沖液，共3份，分別加入上述配制好的 40、50、60 μg/mL 的對(duì)照品溶液，加醋酸鹽緩沖液定容，搖勻，室溫下放置45 min。以醋酸鹽緩沖液作為參比，測(cè)定上述溶液在548 nm處的吸光度。計(jì)算平均回收率及RSD。

1.5 樣品含量測(cè)定

精密量取酸性品紅溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL醋酸鹽緩沖液，分別加入3批五氯柳胺混懸液供試品溶液，加醋酸鹽緩沖液定容，搖勻，室溫下放置45 min。以醋酸鹽緩沖液作為參比，測(cè)定上述溶液在548 nm處的吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算3批樣品中的焦亞硫酸鈉含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在200～800 nm處對(duì)空白溶液、輔料干擾溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示最大吸收波長(zhǎng)為548 nm（圖1至圖4）。

圖1 空白溶液掃描圖譜

圖2 輔料干擾溶液掃描圖譜

圖3 對(duì)照溶液掃描圖譜

圖4 供試品溶液掃描圖譜

2.2 反應(yīng)時(shí)間的選擇

分別以 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60 min作為顯色時(shí)間測(cè)定吸光度 （表1）。由表1可知，在0～25 min吸光度變化明顯，而在40～60 min吸光度較穩(wěn)定，故選擇45 min作為反應(yīng)時(shí)間。

2.3 專屬性試驗(yàn)

在548 nm處測(cè)得空白溶液和輔料干擾溶液的吸光度均為0.875，表明處方中的輔料成分不干擾焦亞硫酸鈉含量的測(cè)定。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別在548 nm處測(cè)定一系列對(duì)照品溶液的吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5），得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.023 c＋0.868，R2=0.992。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按照供試品溶液配制方法配制6份樣品溶液，在548 nm處測(cè)定吸光度（表2）。由表2可知，RSD為0.055 775%，證明其重復(fù)性較好。

2.6 回收率試驗(yàn)

在 548 nm 處測(cè)定 40、50、60 μg/mL 對(duì)照品溶液的吸光度 （表3）。由表3可知，平均回收率為97.09%，RSD 為 0.641 1%，證明該方法準(zhǔn)確度高。

2.7 含量測(cè)定結(jié)果

按照上述焦亞硫酸鈉測(cè)定方法，對(duì)3批五氯柳胺混懸液中的焦亞硫酸鈉含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4中可以看出，3批樣品中的焦亞硫酸鈉的含量均接近3.4 mg/mL，說(shuō)明五氯柳胺混懸液性質(zhì)穩(wěn)定。

表1 不同顯色時(shí)間溶液的吸光度

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 小結(jié)與討論

肝片形吸蟲是寄生于肝臟膽管內(nèi)所引起的一種較常見(jiàn)的人獸共患寄生蟲病，該病分布廣泛，在中國(guó)各地都有發(fā)生［6－8］，然而對(duì)于驅(qū)吸蟲的藥物研究與開(kāi)發(fā)，近年來(lái)一直沒(méi)有突破性進(jìn)展。臨床使用的藥物，例如三氯苯達(dá)唑、氯氰碘柳胺等均已產(chǎn)生耐藥性［9，10］。五氯柳胺作為一種抗肝片吸蟲藥，對(duì)于五氯柳胺的耐藥性國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。五氯柳胺混懸劑研制成功，將對(duì)中國(guó)動(dòng)物寄生蟲病的防治發(fā)揮積極作用，尤其將改變中國(guó)在動(dòng)物吸蟲病防控中缺乏有效藥物的局面，對(duì)促進(jìn)畜牧業(yè)健康發(fā)展、保障公共衛(wèi)生安全具有重要意義。焦亞硫酸鈉作為五氯柳胺混懸液的抗氧化劑，能夠有效降低五氯柳胺混懸液的氧化作用，使其含量保持穩(wěn)定，使制劑能夠達(dá)到長(zhǎng)期儲(chǔ)存的目的。但焦亞硫酸鈉在溶液中會(huì)產(chǎn)生二氧化硫，從而生成亞硫酸鹽，從而對(duì)動(dòng)物造成損害，通過(guò)對(duì)抗氧化劑焦亞硫酸鈉的含量測(cè)定，對(duì)于五氯柳胺的新藥研發(fā)、應(yīng)用以及食品安全控制具有重要的意義。

在反應(yīng)時(shí)間的選擇試驗(yàn)中，文獻(xiàn)［2，4］中反應(yīng)時(shí)間均在25 min，而本研究發(fā)現(xiàn)中，在25 min時(shí)，吸光度仍不穩(wěn)定，證明酸性品紅溶液中亞硫酸鈉未能完全反應(yīng)，而在45 min測(cè)定的溶液吸光度達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，證明亞硫酸鈉反應(yīng)完全，所以將反應(yīng)時(shí)間定為45 min。同時(shí)對(duì)樣品溶液的加入量進(jìn)行了篩選，固定酸性品紅溶液為 2 mL， 分別加入 0.5、1.0、2.0、3.0 mL樣品溶液，在548 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品加入量為 1.0 mL 時(shí)，吸光度在 0.2～0.8，測(cè)得的誤差較小，所以將樣品加入量定為1.0 mL。

在方法學(xué)驗(yàn)證中，連續(xù)對(duì)6份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得吸光度RSD為0.055 775%，證明該方法重復(fù)性好；標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=0.023c＋0.868，R2=0.992，線性關(guān)系好；平均回收率為 97.09%，RSD 為 0.641 1%，證明該方法準(zhǔn)確度高。通過(guò)分析方法結(jié)果驗(yàn)證來(lái)看，該方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、線性關(guān)系好，可用于五氯柳胺混懸液中抗氧化劑焦亞硫酸鈉含量的測(cè)定。