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        五氯柳胺混懸液中抗氧化劑焦亞硫酸鈉含量測(cè)定

        2018-08-02 01:55:34白玉彬張吉麗周緒正張繼瑜
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年13期
        關(guān)鍵詞:品紅亞硫酸鈉定容

        白玉彬,董 朕,張吉麗,周緒正,張繼瑜

        (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,蘭州 730050)

        五氯柳胺(Oxyclozanide)屬于水楊苯胺類(lèi)藥物,是一種氧化磷酸化解偶聯(lián)劑,可降低寄生蟲(chóng)體內(nèi)三磷酸腺甙(ATP)的合成量,從而導(dǎo)致蟲(chóng)體因能量代謝紊亂而最終死亡[1],該藥對(duì)吸蟲(chóng)、絳蟲(chóng)和線(xiàn)蟲(chóng)均具有活性。為滿(mǎn)足獸醫(yī)臨床的需求,本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)了五氯柳胺口服混懸劑,采用焦亞硫酸鈉作為五氯柳胺混懸液的抗氧化劑,以提高制劑的穩(wěn)定性[2-5]。在溶液中焦亞硫酸鈉會(huì)產(chǎn)生二氧化硫,從而生成亞硫酸鹽對(duì)動(dòng)物造成損害,控制焦亞硫酸鈉的含量對(duì)提高產(chǎn)品的安全性具有重要的意義。

        1 材料與方法

        1.1 儀器

        Agilent cary 100 UV-Vis (Agilent Technologies);KQ-600DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UPT-Ⅱ-40L優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司);賽多利斯SQP電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]。

        1.2 試劑

        無(wú)水亞硫酸鈉 (天津市濱海科迪化學(xué)試劑有限公司);酸性品紅(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);冰乙酸(天津恒興試劑);結(jié)晶乙酸鈉(天津市北辰方正試劑廠(chǎng));乙二胺四乙酸二鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng));五氯柳胺混懸液(實(shí)驗(yàn)室自制,批號(hào)20171102、20171103、20171104)。

        1.3 溶液配置

        1.3.1 酸性品紅溶液的配制 精密稱(chēng)量酸性品紅0.34 g,加入1 mL硫酸,加水稀釋并定容至1 000 mL。

        1.3.2 醋酸鹽緩沖液(pH=4.8)的配制 稱(chēng)取結(jié)晶乙酸鈉 136.1 g,乙二胺四乙酸二鈉 0.4 g,加入冰乙酸57 mL。加水溶解并定容至1 000 mL。

        1.3.3 0.04%乙二胺四乙酸二鈉溶液的配制 精密稱(chēng)量乙二胺四乙酸二鈉0.4 g,加水溶解并定容至1 000 mL。

        1.3.4 無(wú)水亞硫酸鈉對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)量無(wú)水亞硫酸鈉10 mg,加入0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液稀釋并定容至50 mL,配制成200 μg/mL作為儲(chǔ)備溶液。精密量取儲(chǔ)備溶液適量,依次使用0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液稀釋為100、80、60、50、40、30、20 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

        1.3.5 供試品溶液的配制 精密量取1 mL五氯柳胺混懸液于100 mL容量瓶中,加入適量0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液,超聲溶解,加0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液定容至100 mL。

        1.3.6 輔料干擾溶液的配制 精密量取1 mL不含焦亞硫酸鈉的五氯柳胺混懸液于100 mL容量瓶中,加入適量0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液,超聲溶解,并定容至100 mL。

        1.4 測(cè)定方法的建立

        1.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 精密量取酸性品紅溶液2mL于25 mL容量瓶中,加入15 mL醋酸鹽緩沖液,共4份,分別加入醋酸鹽緩沖液1 mL(空白溶液)、輔料干擾溶液1 mL、50 μg/mL無(wú)水亞硫酸鈉對(duì)照品溶液1 mL、供試品溶液1 mL,加醋酸鹽緩沖液定容至刻度,搖勻。以醋酸鹽緩沖液為參比,在200~800 nm進(jìn)行掃描。

        1.4.2 反應(yīng)時(shí)間的選擇 精密量取酸性品紅溶液2mL于25 mL容量瓶中,加入15 mL醋酸鹽緩沖液,加入50 μg/mL無(wú)水亞硫酸鈉對(duì)照品溶液1 mL,加醋酸鹽緩沖液定容至刻度,搖勻。室溫下放置5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60 min, 測(cè)定上述溶液在548 nm處的吸光度,選擇吸光度穩(wěn)定的時(shí)間作為反應(yīng)時(shí)間。

        1.4.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密量取酸性品紅溶液2 mL于25 mL容量瓶中,加入15 mL醋酸鹽緩沖液,共2份,分別加入醋酸鹽緩沖液1 mL(空白溶液)和輔料干擾溶液1 mL,加醋酸鹽緩沖液定容至刻度,搖勻。室溫下放置45 min,分別在548 nm處測(cè)定吸光度。測(cè)得空白溶液和輔料干擾溶液的吸光度,觀(guān)察輔料是否會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。

        1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 精密量取酸性品紅溶液2 mL于25 mL容量瓶中,加入15 mL醋酸鹽緩沖液,共7份,分別加入 100、80、60、50、40、30、20 μg/mL 的對(duì)照品溶液,加醋酸鹽緩沖液定容,搖勻,室溫下放置45 min。以醋酸鹽緩沖液作為參比,測(cè)定上述溶液在548 nm處的吸光度。以濃度為橫坐標(biāo),吸光度的倒數(shù)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

        1.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取酸性品紅溶液2 mL于25 mL容量瓶中,加入15 mL醋酸鹽緩沖液,共6份,分別加入供試品溶液,加醋酸鹽緩沖液定容,搖勻,室溫下放置45 min。以醋酸鹽緩沖液作為參比,測(cè)定上述溶液在548 nm處的吸光度。計(jì)算RSD,RSD不得大于2%。

        1.4.6 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取4、5、6 mg無(wú)水亞硫酸鈉于100 mL容量瓶中,加入0.04%的乙二胺四乙酸二鈉溶液定容,搖勻,配制成 40、50、60 μg/mL 的對(duì)照品溶液。精密量取酸性品紅溶液2 mL于25 mL容量瓶中,加入15 mL醋酸鹽緩沖液,共3份,分別加入上述配制好的 40、50、60 μg/mL 的對(duì)照品溶液,加醋酸鹽緩沖液定容,搖勻,室溫下放置45 min。以醋酸鹽緩沖液作為參比,測(cè)定上述溶液在548 nm處的吸光度。計(jì)算平均回收率及RSD。

        1.5 樣品含量測(cè)定

        精密量取酸性品紅溶液2 mL于25 mL容量瓶中,加入15 mL醋酸鹽緩沖液,分別加入3批五氯柳胺混懸液供試品溶液,加醋酸鹽緩沖液定容,搖勻,室溫下放置45 min。以醋酸鹽緩沖液作為參比,測(cè)定上述溶液在548 nm處的吸光度,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算3批樣品中的焦亞硫酸鈉含量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

        在200~800 nm處對(duì)空白溶液、輔料干擾溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液進(jìn)行掃描,結(jié)果顯示最大吸收波長(zhǎng)為548 nm(圖1至圖4)。

        圖1 空白溶液掃描圖譜

        圖2 輔料干擾溶液掃描圖譜

        圖3 對(duì)照溶液掃描圖譜

        圖4 供試品溶液掃描圖譜

        2.2 反應(yīng)時(shí)間的選擇

        分別以 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60 min作為顯色時(shí)間測(cè)定吸光度 (表1)。由表1可知,在0~25 min吸光度變化明顯,而在40~60 min吸光度較穩(wěn)定,故選擇45 min作為反應(yīng)時(shí)間。

        2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

        在548 nm處測(cè)得空白溶液和輔料干擾溶液的吸光度均為0.875,表明處方中的輔料成分不干擾焦亞硫酸鈉含量的測(cè)定。

        2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

        分別在548 nm處測(cè)定一系列對(duì)照品溶液的吸光度,以濃度為橫坐標(biāo),吸光度的倒數(shù)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖5),得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=0.023 c+0.868,R2=0.992。

        2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

        按照供試品溶液配制方法配制6份樣品溶液,在548 nm處測(cè)定吸光度(表2)。由表2可知,RSD為0.055 775%,證明其重復(fù)性較好。

        2.6 回收率試驗(yàn)

        在 548 nm 處測(cè)定 40、50、60 μg/mL 對(duì)照品溶液的吸光度 (表3)。由表3可知,平均回收率為97.09%,RSD 為 0.641 1%,證明該方法準(zhǔn)確度高。

        2.7 含量測(cè)定結(jié)果

        按照上述焦亞硫酸鈉測(cè)定方法,對(duì)3批五氯柳胺混懸液中的焦亞硫酸鈉含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表4。從表4中可以看出,3批樣品中的焦亞硫酸鈉的含量均接近3.4 mg/mL,說(shuō)明五氯柳胺混懸液性質(zhì)穩(wěn)定。

        表1 不同顯色時(shí)間溶液的吸光度

        圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

        表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

        表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

        表4 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果

        3 小結(jié)與討論

        肝片形吸蟲(chóng)是寄生于肝臟膽管內(nèi)所引起的一種較常見(jiàn)的人獸共患寄生蟲(chóng)病,該病分布廣泛,在中國(guó)各地都有發(fā)生[6-8],然而對(duì)于驅(qū)吸蟲(chóng)的藥物研究與開(kāi)發(fā),近年來(lái)一直沒(méi)有突破性進(jìn)展。臨床使用的藥物,例如三氯苯達(dá)唑、氯氰碘柳胺等均已產(chǎn)生耐藥性[9,10]。五氯柳胺作為一種抗肝片吸蟲(chóng)藥,對(duì)于五氯柳胺的耐藥性國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。五氯柳胺混懸劑研制成功,將對(duì)中國(guó)動(dòng)物寄生蟲(chóng)病的防治發(fā)揮積極作用,尤其將改變中國(guó)在動(dòng)物吸蟲(chóng)病防控中缺乏有效藥物的局面,對(duì)促進(jìn)畜牧業(yè)健康發(fā)展、保障公共衛(wèi)生安全具有重要意義。焦亞硫酸鈉作為五氯柳胺混懸液的抗氧化劑,能夠有效降低五氯柳胺混懸液的氧化作用,使其含量保持穩(wěn)定,使制劑能夠達(dá)到長(zhǎng)期儲(chǔ)存的目的。但焦亞硫酸鈉在溶液中會(huì)產(chǎn)生二氧化硫,從而生成亞硫酸鹽,從而對(duì)動(dòng)物造成損害,通過(guò)對(duì)抗氧化劑焦亞硫酸鈉的含量測(cè)定,對(duì)于五氯柳胺的新藥研發(fā)、應(yīng)用以及食品安全控制具有重要的意義。

        在反應(yīng)時(shí)間的選擇試驗(yàn)中,文獻(xiàn)[2,4]中反應(yīng)時(shí)間均在25 min,而本研究發(fā)現(xiàn)中,在25 min時(shí),吸光度仍不穩(wěn)定,證明酸性品紅溶液中亞硫酸鈉未能完全反應(yīng),而在45 min測(cè)定的溶液吸光度達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),證明亞硫酸鈉反應(yīng)完全,所以將反應(yīng)時(shí)間定為45 min。同時(shí)對(duì)樣品溶液的加入量進(jìn)行了篩選,固定酸性品紅溶液為 2 mL, 分別加入 0.5、1.0、2.0、3.0 mL樣品溶液,在548 nm處測(cè)定吸光度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)樣品加入量為 1.0 mL 時(shí),吸光度在 0.2~0.8,測(cè)得的誤差較小,所以將樣品加入量定為1.0 mL。

        在方法學(xué)驗(yàn)證中,連續(xù)對(duì)6份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得吸光度RSD為0.055 775%,證明該方法重復(fù)性好;標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為 y=0.023c+0.868,R2=0.992,線(xiàn)性關(guān)系好;平均回收率為 97.09%,RSD 為 0.641 1%,證明該方法準(zhǔn)確度高。通過(guò)分析方法結(jié)果驗(yàn)證來(lái)看,該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、線(xiàn)性關(guān)系好,可用于五氯柳胺混懸液中抗氧化劑焦亞硫酸鈉含量的測(cè)定。

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