劉倩茹，柏圣達(dá)，趙國(guó)雨，徐云峰，楊最素

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院／浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316022）

魷魚是海洋生物中重要的頭足類動(dòng)物，其生長(zhǎng)周期短、繁殖能力強(qiáng)及資源恢復(fù)迅速，是一種可持續(xù)發(fā)展的海洋漁業(yè)資源。近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外深海捕撈技術(shù)的發(fā)展，魷魚業(yè)已成為中國(guó)主要的遠(yuǎn)洋捕撈和水產(chǎn)加工品種。目前，中國(guó)年魷魚加工量達(dá)40～50萬(wàn)t，居世界第一位，加工品種主要為阿根廷魷魚、北太平洋魷魚和秘魯魷魚。魷魚的肉細(xì)膩，風(fēng)味鮮美，富含高蛋白低脂肪，包含人體所需的多種必需氨基酸，備受消費(fèi)者青睞。在魷魚的加工過(guò)程中，一般對(duì)其胴體進(jìn)行加工，產(chǎn)生約有35%的魷魚頭、內(nèi)臟及表皮等下腳料，除部分加工成魚粉外，一般都采用掩埋處理，造成資源的大量浪費(fèi)，因此學(xué)者們對(duì)如何綜合利用魷魚下腳料開展了廣泛的研究［1］。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，魷魚皮膠原蛋白的小分子肽具有良好的降血壓、調(diào)血脂、抗氧化等多種生理功能，在食品、醫(yī)療及保健品方面具有良好的應(yīng)用前景［2，3］。 魷魚墨多肽具有抗腫瘤活性［4］，魷魚墨黑色素鐵能夠顯著促進(jìn)大鼠造血細(xì)胞的生長(zhǎng)，改善缺鐵性貧血大鼠的貧血癥狀，是貧血類保健食品的良好原料［5，6］。魷魚內(nèi)臟含較高的?；撬?、維生素和鋅等成分，可作為強(qiáng)化食品的原料，作為制造醬油或天然調(diào)味品的原料［7，8］。 而生殖腺（纏卵腺、精巢、卵巢等）占內(nèi)臟的20%，這些內(nèi)臟等副產(chǎn)物，通常被加工成飼料，作為魚的誘餌［9］；魷魚纏卵腺等通常只作烹飪食用，生物附加值低并且未及時(shí)處理會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定的污染。研究表明，雄性魷魚精巢組織提取物具有抗疲勞、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)功能，在海洋保健食品中有廣闊的應(yīng)用前景［10］。精巢中可獲得魚精蛋白，具有抑制多種食品腐敗菌的生長(zhǎng)，且具有促消化、助呼吸、降血壓、抑制腫瘤生長(zhǎng)等生理活性，魚精蛋白因其良好的天然性和抗菌性受到廣泛關(guān)注，已作為化學(xué)防腐劑的替代品出現(xiàn)在食品添加劑行列［11］。關(guān)于魷魚雌性生殖腺——纏卵腺的研究不多，王倩等［12，13］、劉淑集等［14］從魷魚纏卵腺中提取糖蛋白，發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗疲勞、降血脂及提高非特異性免疫的功能，但關(guān)于魷魚纏卵腺酶解多肽的提取目前鮮見報(bào)道。本研究以魷魚纏卵腺為原料，通過(guò)優(yōu)化的酶解方法提取多肽，評(píng)價(jià)其體外的抗氧化活性，以期為魷魚纏卵腺的開發(fā)利用提高試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北太平洋魷魚（Todarodes pacificus）纏卵腺，購(gòu)于舟山本地水產(chǎn)品企業(yè)；堿性蛋白酶購(gòu)于亞太恒信生物科技（北京）有限公司；1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH）購(gòu)于西亞試劑；菲洛嗪、鄰二氮菲、三氯化鐵、磷酸氫二鈉購(gòu)于阿拉丁試劑公司；其余試劑均為分析純購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SSW－420－2S恒溫水浴鍋 （上海民儀電子有限公司）；BSA124S型電子天平 （德國(guó)SartoriusAG公司）；DS－1 組織搗碎機(jī) （上海標(biāo)本模型廠）；PHS－250PH計(jì)（上海理達(dá)儀器廠）；CF16RXⅡ型高速低溫離心機(jī) （日本日立公司）；Direct－Q 5 UV－R型超純水系統(tǒng)和Cogentk?μ Scale型超濾系統(tǒng) （美國(guó)Millipore 公司）；ALPHA 1－4／LDplus 型冷凍干燥機(jī)（德國(guó) CHRIST 公司）；紫外分光光度計(jì)（752FC）（上海光譜儀器有限公司）；Agilent－1260型高效液相色譜儀 （美國(guó)安捷倫公司）；PPSQ－31A蛋白自動(dòng)測(cè)序儀（日本島津制作所）。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗(yàn) 選用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解試驗(yàn)，考慮酶解的溫度、時(shí)間、加酶量、溶液pH和料液比5個(gè)因素，將試驗(yàn)分成5組進(jìn)行，每組均取相同量（10 g）的魷魚纏卵腺勻漿5份，比較堿性蛋白酶在不同水解條件下的水解度，以水解物的ANN含量為指標(biāo)，從而確定較為適合的堿性蛋白酶水解條件范圍。氨基氮含量（ANN）與水解度成正相關(guān)，采用甲醛電位滴定法測(cè)定。

水解工藝：魷魚纏卵腺搗碎→勻漿→1 mol／L氫氧化鈉調(diào)pH→保溫→加酶后水解→滅酶（90℃加熱15min）→離心（10000r／min、15min）→上清液定容→游離氨基氮含量（AAN）測(cè)定。

1）溫度。 料液比 1∶6，調(diào) pH 至 8，加 2 500 U／g的酶，在不同溫度下（30、35、40、45、50 ℃）酶解 7 h。

2）時(shí)間。 料液比 1∶6，調(diào) pH 至 8，加 2 500 U／g的酶，在 45 ℃下恒溫酶解不同時(shí)間（5、6、7、8、9 h）。

3）加酶量。料液比為1∶6，調(diào)pH至8，加入不同量（1 500、2 000、2 500、3 000、3 500 U／g）的酶，在45 ℃下恒溫酶解7 h。

4）pH。 料液比為 1∶6，調(diào)至不同 pH（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0），加 2 500 U／g 的酶，在 45 ℃下恒溫酶解7 h。

5）料液比。 加不同料液比（1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7），調(diào)pH至8，加2 500 U／g的酶，在45℃下恒溫酶解7 h。

1.3.2 正交試驗(yàn) 經(jīng)單因素試驗(yàn)確定較優(yōu)試驗(yàn)條件范圍，考慮 5 個(gè)因素，即溫度（A）、時(shí)間（B）、pH（C）、加酶量（D）和料液比（E），選取 L16（45）的正交試驗(yàn)，用DPPH清除率來(lái)評(píng)價(jià)不同水解條件下的抗氧化活性。

1.3.3 酶解液超濾 使用超濾杯截取分子量分別為3、5、8、10、30 ku 的超濾膜，將酶解液在 25 ℃環(huán)境中分別超濾 12 h，截取獲得＜3 ku、3～5 ku、5～8 ku、8～10 ku、10～30 ku和＞30 ku分子量的酶解液，冷凍干燥后分別測(cè)定抗氧化活性。

1.3.4 測(cè)定方法 酶解液對(duì)DPPH清除率的測(cè)定參照文獻(xiàn)［15，16］并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。酶解液對(duì)·OH自由基清除率的測(cè)定參照文獻(xiàn)［17－19］并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。酶解液對(duì)O2－清除率的測(cè)定參照文獻(xiàn)［20－22］并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，酶解液對(duì)Fe2＋螯合能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)［22－24］并作適當(dāng)改進(jìn)。酶解液還原能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)［23－25］并作適當(dāng)改進(jìn)。

1.3.5 Sephadex G－25層析分離 取抗氧化活性最佳的多肽分子段，凍干樣品后進(jìn)行瓊脂糖凝膠G－25層析分離，樣品濃度為0.2 g/mL，離心后留取上清液，過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)行洗脫。洗脫柱尺寸2.6 cm×60 cm；以瓊脂糖凝膠G－25填料；柱料顆粒為50～150 μm；上樣量 2 mL；取去離子水為洗脫液；流速1.1 mL/min；收集體積為 3.5 mL/管，在 280 nm 處收集各個(gè)峰的組分后再進(jìn)行冷凍干燥，并檢測(cè)抗氧化活性（以DPPH清除率為標(biāo)準(zhǔn)）。

1.3.6 高效液相分離純化及目標(biāo)肽N端序列測(cè)定根據(jù)上一步各個(gè)峰對(duì)DPPH清除率的檢測(cè)得到最佳活性峰組分，大量收集此峰經(jīng)HPLC反復(fù)制備，獲得單一峰后，委托北京億譜生物技術(shù)有限公司完成蛋白質(zhì)的N端序列檢測(cè)工作。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溫度 如圖1所示，當(dāng)酶解溫度在30～45℃之間，生成的北太平洋魷魚纏卵腺ANN會(huì)逐漸增多，45℃時(shí)達(dá)到最高，而到50℃有所下降。因此，正交試驗(yàn)選擇的溫度范圍為40～50℃。

圖1 溫度對(duì)太平洋魷魚纏卵腺ANN的影響

2.1.2 時(shí)間 如圖2所示，當(dāng)酶解時(shí)間在6 h時(shí)，生成的北太平洋魷魚纏卵腺ANN最多，7 h后逐漸減少。因此，選擇酶解時(shí)間在5～7 h。

2.1.3 pH 如圖3所示，當(dāng)pH為9.0時(shí)生成的北太平洋魷魚纏卵腺 ANN 最多，pH 為 8.0、10.0 時(shí)，生成的ANN相差不大，因此正交試驗(yàn)選擇pH在8.0～10.0。

2.1.4 加酶量 加酶量單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。當(dāng)加酶量位于1 500～3 500 U/g，生成的北太平洋魷魚纏卵腺ANN隨加酶量的增加而增加，可能加入的酶越多，酶與原料接觸越充分，效果也越好。因此，正交試驗(yàn)選擇加酶量位于2 500～3 500 U/g。

2.1.5 料液比 料液比單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。當(dāng)料液比為 1∶3～1∶7時(shí)，隨著料液比的增加，生成的北太平洋魷魚纏卵腺ANN逐漸減少。因此，正交試驗(yàn)選擇料液比在 1∶3～1∶5。

圖2 時(shí)間對(duì)太平洋魷魚纏卵腺ANN的影響

圖3 pH對(duì)太平洋魷魚纏卵腺ANN的影響

圖4 加酶量對(duì)太平洋魷魚纏卵腺ANN的影響

圖5 料液比對(duì)太平洋魷魚纏卵腺ANN的影響

2.2 堿性蛋白酶酶解條件的優(yōu)化

在初步確定酶解條件的基礎(chǔ)上，選擇溫度、pH、時(shí)間、料液比和加酶量5個(gè)因素設(shè)計(jì)4水平正交試驗(yàn)L16（45），確定最佳酶解工藝，結(jié)果見表 1。由表1可知，影響堿性蛋白酶水解物羥自由基清除率的各因素中，由大到小排列順序?yàn)锽＞A＞E＞D＞C，即時(shí)間＞溫度＞料液比＞加酶量＞pH，而且組合A4B3C3D4E4效果最好，即選擇溫度50℃、酶解時(shí)間7 h、加酶量3 500 U/g、pH 9.0、料液比為 1∶6 為最佳酶解條件。

表1 堿性蛋白酶的酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 酶解物最佳分子段的選取

將最佳水解條件下得到的水解物經(jīng)超濾后分離得到＜3 ku、3～5 ku、5～8 ku、8～10 ku、10～30 ku、＞30 ku不同分子量的多肽，經(jīng)冷凍干燥，檢測(cè)濃度為0.5 mg/mL時(shí)酶解多肽的還原能力、羥自由基清除率、DPPH清除率、超氧陰離子清除率、Fe2＋螯合率，測(cè)定結(jié)果見圖6。從圖6至圖10可以看出，不同分子量的酶解多肽均有一定的抗氧化能力，但以3～5 ku的酶解多肽清除率最高。因此，下步試驗(yàn)將選取該分子段進(jìn)行分離純化。

2.4 Sephadex G-25分離純化結(jié)果

取3～5 ku分子段凍干樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠Sephadex G－25層析，于280 nm處出現(xiàn)3個(gè)峰，即峰玉、峰Ⅱ和峰Ⅲ，結(jié)果見圖11。分別收集3個(gè)峰組分經(jīng)冷凍干燥，當(dāng)濃度為0.5 mg/mL檢測(cè)其對(duì)DPPH的清除率，得出峰玉有較好的清除能力，結(jié)果見圖12，取峰玉分子段進(jìn)行HPLC的純化。

圖6 酶解多肽不同分子段的還原能力

圖7 酶解多肽不同分子段對(duì)羥自由基的清除率

圖8 酶解多肽不同分子段對(duì)DPPH的清除率

圖9 酶解多肽不同分子段對(duì)超氧陰離子清除率

圖10 酶解多肽不同分子段的Fe2+螯合率

圖11 3～5 ku分子段在280 nm處的吸光度

圖12 3～5 ku分子段的DPPH清除率

2.5 HPLC分離純化及目標(biāo)肽N端序列測(cè)定結(jié)果

峰玉經(jīng)HPLC色譜柱反復(fù)制備，結(jié)果如圖13所示。保留時(shí)間約為11.8 min時(shí)，出現(xiàn)單一峰，經(jīng)氨基酸序列儀N端序列檢測(cè)，其氨基酸序列為Ala－Tyr－Ala－Ser－Ser，相對(duì)分子質(zhì)量為 497.50，其結(jié)構(gòu)式見圖14。

圖13 峰玉在219 nm處的高效液相色譜

圖14 目標(biāo)肽氨基酸分子結(jié)構(gòu)式

3 小結(jié)

以北太平洋魷魚纏卵腺為試驗(yàn)原料，結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，篩選出堿性蛋白酶的酶解條件，即溫度50℃、酶解時(shí)間7 h、加酶量3 500 U/g、pH 9.0且料液比1∶6。影響堿性蛋白酶水解物DPPH清除率的各因素中，時(shí)間＞溫度＞料液比＞加酶量＞pH。酶解液經(jīng)超濾獲得不同分子段，經(jīng)抗氧化試驗(yàn)得出最佳抗氧化分子段為3～5 ku。經(jīng)瓊脂糖凝膠G－25層析后，得出3個(gè)峰，根據(jù)對(duì)DPPH清除率的測(cè)定，得出峰玉效果明確，當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí)其DPPH的清除率為61.87%，后經(jīng)HPLC分離純化并經(jīng)目標(biāo)肽N端序列檢測(cè)，得到該目標(biāo)肽的氨基酸序列為 Ala－Tyr－Ala－Ser－Ser。 因此，認(rèn)為應(yīng)用現(xiàn)代生物制備技術(shù)酶解北太平洋魷魚纏卵腺，可獲得抗氧化活性較好的寡肽，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)在的價(jià)值，增加其附加值，避免優(yōu)質(zhì)蛋白的大量流失，可為魷魚纏卵腺的精深加工和高值化利用開拓一條新的途徑。