張艷麗 楊雁蕓 白志堯 曹彥剛 孫亞萍 劉 通 克迎迎

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州 450046；2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450046

黨參為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.、素 花 黨 參 Codonopsis pilosula Nannf.Var.modesta（Nannf.）L.T.Shen 或 川 黨 參Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根[1]。其性甘味平，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺之功效，是中藥中具有代表性的補(bǔ)益藥物，在臨床上應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)代研究表明，黨參水提液具有調(diào)節(jié)血糖[2]、增強(qiáng)免疫力[3]、促進(jìn)造血機(jī)能[4]、提高學(xué)習(xí)記憶能力[5]、調(diào)節(jié)胃收縮及抗?jié)僛6]、抗衰老[7]等作用。核苷是生物細(xì)胞維持生命活動(dòng)重要元素，參與代謝過(guò)程，具有抗腫瘤[8]、抗病毒[9]、調(diào)節(jié)免疫功能[10]等多種藥理作用，被認(rèn)為是補(bǔ)益類中藥共有的物質(zhì)基礎(chǔ)。超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用具有卓越的分離能力、高選擇性，高靈敏度，快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多地應(yīng)用于中藥材微量和痕量成分的檢測(cè)[11-12]。目前在黨參質(zhì)量評(píng)價(jià)方面，以黨參炔苷的含量為指標(biāo)，而關(guān)于核苷類成分的含量測(cè)定，尚未見(jiàn)到相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)參照其他有關(guān)核苷成分含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道[13-14]，對(duì)黨參中7種核苷成分進(jìn)行了定性、定量分析，為黨參的化學(xué)成分、藥理作用，和多指標(biāo)質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)4批不同來(lái)源黨參飲片中腺苷、肌苷、尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、次黃嘌呤和2'-脫氧腺苷7種核苷類成分進(jìn)行含量測(cè)定，為黨參藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與儀器

ACQUITY系統(tǒng)超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，包括二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器和Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站（美國(guó) Waters公司）；AB135-S型十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Centrifuge-5418小型高速低溫冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；BT25S萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；XK80-A快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）；KQ-300DB型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；DFZ-60508型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

腺 苷（批 號(hào)：Z23S7J21814）、肌 苷（批 號(hào)：TJ0623XA13）、尿 嘧 啶（批 號(hào)：T14A8X33880）尿 苷（批 號(hào)：TM0313XA13）、腺 嘌 呤（批 號(hào)：X18N6M6005）、次黃嘌呤（批號(hào)：TM0313XA13）、2'-脫氧腺苷（批號(hào)：N27A8W34890）對(duì)照品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，純度＞98%；甲醇、乙腈（色譜純，Thermofisher公司），甲酸（質(zhì)譜級(jí)，Thermofisher公司），實(shí)驗(yàn)用水為超純水。4批黨參飲片購(gòu)買于鄭州各大藥房，來(lái)源見(jiàn)表1，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的干燥根。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液

精密稱取腺苷等7種對(duì)照品，分別置于10mL容量瓶中，加10%甲醇溶解并定容，搖勻，分別得含腺苷80.3μg/mL、肌苷84.1μg/mL、尿嘧啶82.8μg/mL、 尿苷 82.5μg/mL、腺嘌呤 79.9μg/mL、次黃嘌呤90.5μg/mL和2'-脫氧腺苷89.6μg/mL單一成分對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液，量取各儲(chǔ)備液配置成系列濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液

稱取黨參藥材粉末（過(guò)3號(hào)篩）約1g，精密稱定，置25mL具塞錐形瓶中，精密加入10%甲醇10mL，稱定質(zhì)量，超聲（250W，40kHz）提取 30min，放冷至室溫，以10%甲醇補(bǔ)足減失重量。12000r/min離心2次，每次5min，取上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾得供試品溶液。

2.3 色譜條件

采 用 Acquity UPLC BEH C18柱（2.1mm×50mm，1.7μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0～ 3 min，5% ～ 10%A；3～ 5min，10% ～ 15%A；5～ 9min，15% ～ 5%A；9～10 min，5%A）；柱溫30℃；流速：0.2mL/min；進(jìn)樣量：2μL。

2.4 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離源（ESI），正離子掃描；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電離電壓3.5kV；離子源溫度150℃；去溶劑氣N2，流速300L/h，去溶劑氣溫度300℃；碰撞氬氣，流速0.3mL/min。7種核苷類化合物在MRM模式下質(zhì)譜分析條件見(jiàn)表2，MRM離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 7種核苷樣品的MRM

2.5 線性關(guān)系、檢出限和定量限

取“2.1”項(xiàng)下制備的系列濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.2”和“2.3”項(xiàng)下條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定3次，記錄各個(gè)化合物特征碎片離子峰面積，以對(duì)被測(cè)成分的質(zhì)量濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)，對(duì)照品的峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信噪比S/N=3和S/N=10時(shí)計(jì)算被檢測(cè)化合物的檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ），見(jiàn)表3。結(jié)果表明，7種核苷類成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2≥0.9976），檢測(cè)限為0.032～4.614μg/L，定量限為0.163～15.817μg/L。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

取上述同一混合對(duì)照品溶液，按“2.2”和“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次2μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果顯示7種核苷類成分峰面積的RSD為0.93%～2.71%，表明該方法有較好的精密度。

表2 優(yōu)化的質(zhì)譜條件參數(shù)

表3 黨參中7種核苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

表4 黨參中7種核苷同時(shí)測(cè)定方法的加樣回收率考察結(jié)果（n=3）

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品（17071001）6份，分別制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示7種核苷類化合物含量的RSD值1.26%～2.29%，表明實(shí)驗(yàn)所建立的方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為17071001的黨參樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下，分別于0、2、4、6、8、10h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示 7 種核苷含量的 RSD為0.82%～2.98%，表明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率實(shí)驗(yàn)

稱取已知含量批號(hào)為17071001的黨參樣品1g，6份，精密稱定，分別精密加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備加樣回收率供試品溶液，按“2.3”和“2.4”項(xiàng)下進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各個(gè)化合物的平均加樣回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表4，表明本方法在3個(gè)濃度添加水平下，7種核苷類成分的加樣回收率為95.56%～104.03%，RSD均＜3.0%，能滿足黨參藥材中7種核苷類成分的測(cè)定要求。

表5 黨參中7種核苷的含量（μg/g，n=3）

2.10 樣品測(cè)定

分別精密稱取不同批號(hào)的樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述優(yōu)化好的條件進(jìn)行7種核苷類成分的含量測(cè)定，把各組分峰面積代入回歸方程計(jì)算得到樣品中7種核苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

3.1 提取方法的考察

本文考察了提取溶劑（水、0.1%甲酸水、10%甲醇、30% 甲醇、50% 甲醇），溶劑用量（5、10、25、50mL），超聲提取時(shí)間（10、30、45、60min），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最終確定的“2.2項(xiàng)”下供試品溶液的制備方法為最優(yōu)方法。

3.2 色譜-質(zhì)譜條件的考察

Acquity UPLC BEH C18柱采用三鍵鍵合化學(xué)，對(duì)強(qiáng)極性的化合物具有很好的保留作用，適用于核苷類成分的分離。另外本文對(duì)常用流動(dòng)相乙腈-水系統(tǒng)、甲醇-水系統(tǒng)、甲醇-0.1%甲酸水系統(tǒng)進(jìn)行了考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示甲醇-0.1%甲酸水系統(tǒng)作為流動(dòng)相時(shí)7種核苷類化合物的靈敏度高于乙腈-水系統(tǒng)和甲醇-水系統(tǒng)，分離效果較好，出峰緊湊且峰型對(duì)稱。核苷類化合物在正離子模式下的響應(yīng)較負(fù)離子模式更為穩(wěn)定，因此選擇正離子模式作為質(zhì)譜的離子化模式。

黨參為臨床常用補(bǔ)益類中藥，核苷作為補(bǔ)益類中藥共有的物質(zhì)基礎(chǔ)，制定其快速穩(wěn)定的含量測(cè)定十分必要。文獻(xiàn)報(bào)道腺苷具有改善血液循環(huán)，防止心律失常[15]等活性。隨著現(xiàn)代藥理學(xué)及核苷的系列產(chǎn)品開(kāi)發(fā)利用，核苷在制備增強(qiáng)機(jī)體免疫力的食品、藥品和保健品中廣泛應(yīng)用。核苷類含量測(cè)定方法主要有反相高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法，然而，核苷類化合物極性較強(qiáng)、化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，在反相柱上不易保留、分離度低及共流出的問(wèn)題，給分離分析帶來(lái)挑戰(zhàn)。超高效液相色譜法（UPLC）是利用小顆粒填料（＜2μm）作為固定相和超高壓系統(tǒng)（＞105kPa）的新型色譜技術(shù)，與傳統(tǒng)高效液相法相比具有高分離度、高分辨率、高檢測(cè)靈敏度等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)結(jié)合三重四級(jí)桿多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)母離子和子離子的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)，從而獲取靈敏度高和重現(xiàn)性好的定性和定量離子，實(shí)現(xiàn)更加準(zhǔn)確的定性定量，避免假陽(yáng)性的結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)所建立的UPLC-MS/MS法可同時(shí)對(duì)黨參中得腺苷、肌苷、尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、次黃嘌呤和2'-脫氧腺苷7種核苷進(jìn)行定量測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同批次黨參藥材中7種核苷含量差異不大，且腺苷的含量最高，遠(yuǎn)高于其他成分，肌苷、次黃嘌呤、尿苷、2'-脫氧腺苷的含量較低，不同批次黨參中核苷類成分含量有所差異，其原因可能與藥材生長(zhǎng)氣候條件、土壤情況及采收時(shí)期等多種因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)建立的UPLC-MS/MS法可快速、準(zhǔn)確地同時(shí)測(cè)定黨參中7種核苷類成分的含量，該方法簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定、可靠，為提高黨參藥材以及含黨參中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。