張 凡 趙 遠(yuǎn) 曹麗娟 姜恒麗 賈天柱▲

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600；2.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116600；3.上藥康麗(常州)藥業(yè)有限公司，江蘇常州 213100；4.盛實(shí)百草藥業(yè)有限公司，天津 300301

四君子湯首載于《太平惠民和劑局方》，組方為人參、麩白術(shù)、茯苓、炙甘草，是益氣健脾，為治療脾胃氣虛證的基礎(chǔ)方劑[1]。生脈飲首載于《醫(yī)學(xué)起源》，組方為人參，麥冬，五味子，功效為益氣生津，斂陰止汗，多用于心血管疾病的治療[2]。在原方中四君子湯是以生曬參納入方劑用藥的，而生脈飲中則是以紅參納入方劑的。人參作為百草之王，有多種炮制品，常用的炮制品為生曬參和紅參。生曬參經(jīng)過(guò)蒸制而得紅參，在炮制過(guò)程中活性成分發(fā)生了量變和質(zhì)變[3]。在臨床應(yīng)用方面，生曬參多用于補(bǔ)氣生津，治療氣陰不足，津傷口渴等癥，以清補(bǔ)為佳； 紅參則味甘性溫，以溫補(bǔ)為主，常用于治療體虛欲脫，肢冷脈微，氣不攝血等癥[4]。藥效學(xué)顯示，四君子湯和生脈飲均有一定的免疫調(diào)節(jié)的作用[5-6]，但在四君子湯和生脈飲中，這兩種方劑的原方選擇不同的人參炮制品入藥，其原理并沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，故在本實(shí)驗(yàn)中先應(yīng)用CCK-8法測(cè)定RAW264.7細(xì)胞存活率來(lái)篩選給藥濃度，ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO、ROS、TNF-α的含量來(lái)評(píng)價(jià)免疫效果，進(jìn)而從體外細(xì)胞效應(yīng)角度評(píng)價(jià)人參生熟飲片對(duì)四君子湯和生脈飲對(duì)免疫調(diào)節(jié)的差異，確定四君子湯中最佳的人參炮制品種。故本實(shí)驗(yàn)以不同的側(cè)重點(diǎn)，將不同飲片納入相同方劑，將相同飲片納入不同方劑，以期找出差別，說(shuō)明原理，進(jìn)而從方劑層面說(shuō)明人參的生熟差異，為人參在臨床使用中提供科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)人參的合理用藥提供科學(xué)依據(jù)[7]。

1 材料與方法

1.1 藥材

人參鮮品購(gòu)自遼寧省桓仁縣，對(duì)照2010版中華人民共和國(guó)藥典鑒定為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey）的根。各人參炮制品由遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心制備。白術(shù)（購(gòu)自安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，批號(hào)：111018），茯苓塊（購(gòu)自安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，批號(hào)：120716），甘草（購(gòu)自安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，批號(hào)：120608），麥冬（購(gòu)自安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，批號(hào)：120506），五味子購(gòu)自丹東大梨樹(shù)五味子GAP基地。

1.2 試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（Thermo公司）；胎牛血清（Thermo公司）；胰酶、EDTA （Reanta公司） 青霉素、鏈霉素雙抗（Thermo公司）；中性紅粉末（上海哈靈生物醫(yī)藥科技有限公司）；HANKS液（上海哈靈生物醫(yī)藥科技有限公司）；CCK-8試劑盒 （上海哈靈生物醫(yī)藥科技有限公司）； NO、ROS、TNF-αELISA試劑盒（上海哈靈生物藥業(yè)有限公司）；DMSO 為ACS級(jí)；75%醫(yī)用消毒酒精；小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株（由美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)ATCC提供），并凍存于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)炮制實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱中備用。

1.3 儀器

超凈工作臺(tái)（上海智城 ZHJH-C1112B），倒置顯微鏡（寧波永新NIB-100），CO2培養(yǎng)箱（日本三洋MCO-15AC），Alpha 4冷凍干燥機(jī)（Christ北京思達(dá)興業(yè)儀器有限公司）Multiskan MK3酶標(biāo)儀（Thermo公司），細(xì)胞培養(yǎng)用具等。

1.4 方法

1.4.1 樣品制備 生曬參四君子湯的制備：取生曬參、麩白術(shù)、茯苓、炙甘草按照3∶3∶3∶2的比例400mg，加10倍量的蒸餾水浸泡0.5 h，煎煮2次后，過(guò)濾，合并濾液，濃縮并凍干成粉，再用DMEM溶解凍干粉，配制成含生藥量為100、200、400、800、1600、3200、4000mg/L 的 培 養(yǎng) 液，混 勻，0.22μm 濾膜濾過(guò)，置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

紅參四君子湯的制備：將上方中的生曬參換為紅參，用制備生曬參四君子湯的方法制備紅參四君子湯，制備相同濃度的含藥培養(yǎng)基，保存?zhèn)溆谩?/p>

生曬參生脈飲的制備：取生曬參、麥冬。五味子按照1∶2∶1的比例400mg，加10倍量的蒸餾水浸泡0.5h，煎煮2次后，過(guò)濾，合并濾液，濃縮并凍干成粉，再用DMEM溶解凍干粉，配制成含生藥量為 100、200、400、800、1600、3200、4000mg/L 的培養(yǎng)液，混勻，0. 22μm 濾膜濾過(guò)，置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

紅參生脈飲的制備：將上方中的生曬參換為紅參，用制備生曬參生脈飲的方法制備紅參生脈飲，制備相同濃度的含藥培養(yǎng)基，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)，DMEM 培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%青鏈霉素雙抗，置于 37℃ ，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25% 胰酶消化傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 CCK-8法篩選RAW264.7細(xì)胞不同給藥濃度 以生曬參四君子湯及紅參生脈飲為例，篩選最佳的給藥濃度范圍。調(diào)整細(xì)胞濃度至3×104/mL 接種至入 96 孔板100μL，并留出1個(gè)孔，不加細(xì)胞懸液，作為空白對(duì)照組，培養(yǎng)24h后，再棄去原培養(yǎng)液，并在 96 孔板中依次加入生曬參四君子湯 4000，3200，1600，800，400，200mg/L 各 10μL，不加藥液的不干預(yù)組作對(duì)照； 培養(yǎng)24 h，加入10μL CCK-8試劑后再孵育4h，用酶標(biāo)儀以540nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度 A。每給藥組設(shè)5個(gè)副孔，取平均值計(jì)算其細(xì)胞活力 = （A藥液-A空白）/（ A不干預(yù)-A空白）× 100%。

1.4.4 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的影響[8]將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板，貼壁后加入100、200、400和800mg/L濃度的生曬參四君子湯，紅參四君子湯，生曬參生脈飲，紅參生脈飲藥物（以下簡(jiǎn)稱生四君，紅四君，紅生脈和生生脈），孵育24h，棄上清，加質(zhì)量濃度為0.75g/L中性紅200μL/孔，置37℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)30min后棄上清，Hanks液200μL/孔，洗3遍，最后每孔加150μL Hanks液，反復(fù)凍融，直到細(xì)胞破裂，540nm下測(cè)定OD值，按下公式計(jì)算吞噬增加率／%=（A藥液-A對(duì)照）/A對(duì)照×100%。每給藥組設(shè) 3 個(gè)副孔。

1.4.5 對(duì)巨噬細(xì)胞NO、ROS、TNF-α釋放的影響[9-11]RAW264.7細(xì)胞消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104/mL，向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h待其貼壁后，棄去上清液。處理組各加入200μL的生四君，紅四君，紅生脈和生生脈提取液，對(duì)照組加入200μL DMEM完全培養(yǎng)液。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，取上清液，ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液中NO、ROS、TNF-α的含量。每給藥組設(shè) 3 個(gè)副孔。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)資料以（x±s）表示，統(tǒng)計(jì)方法用單因素方差分析與組間LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAW264.7 各組給藥藥液濃度篩選

隨著四君子湯（ 紅參） 藥液濃度的增加，細(xì)胞的活力逐漸減弱，表明藥液濃度過(guò)高會(huì)對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用； 選擇細(xì)胞活力最接近不干預(yù)組的4 個(gè)濃度，確定給藥濃度為100～800mg/L，見(jiàn)表1。

2.2 各給藥組對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅吸光度和增長(zhǎng)率的影響

測(cè)量結(jié)果與計(jì)算結(jié)果分別見(jiàn)表2 ～ 3。從測(cè)量得到的結(jié)果可以看出，四君子湯與生脈飲能夠顯著的增加巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的吸光度（P＜0.05），從表中可以看出，隨著濃度的增加，吸光度逐漸增加，當(dāng)濃度達(dá)到400mg/L時(shí)，吸光度達(dá)到最大，再增加給藥濃度，吸光度出現(xiàn)下降的趨勢(shì)；同劑量與生四君組比較，在100mg/L時(shí)紅四君有顯著差異為（0.80±0.05），在200mg/L時(shí)生生脈有顯著差異，吸光度為（0.75±0.10）；在800mg/L時(shí)生生脈有顯著差異，吸光度為（0.60±0.08），其余同劑量組間沒(méi)有顯著差異。

表 1 不同濃度生曬參四君子湯對(duì)心肌細(xì)胞活力影響（x ± s，n=5）

表2 各給藥組對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅吸光度的影響（x ± s，n=3）

表3 各給藥組對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅增長(zhǎng)率的影響（n=3，%）

2.3 各給藥組對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO的影響

計(jì)算結(jié)果分別見(jiàn)表4。從測(cè)量得到的結(jié)果可以看出，四君子湯與生脈飲能夠顯著的增加巨噬細(xì)胞上清液中NO的含量（P＜0.05）；從表中可以看出，隨著濃度的增加，NO的釋放量逐漸增加，當(dāng)濃度達(dá)到400mg/L時(shí)，釋放量達(dá)到最大，再增加給藥濃度，釋放量出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，400mg/L時(shí)，NO釋放量存在顯著差異（P＜0.05）；同劑量時(shí)與生四君組比較，生四君組400mg/L對(duì)巨噬細(xì)胞NO的影響為（24.31±1.93）μmol/L均高于其同劑量其他三組。

表4 各給藥組對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO的影響（μmol/L，x ± s，n=3）

表5 各給藥組對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞ROS的影響（IU/mL，x ± s，n=3）

表6 各給藥組對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α的影響（ng/L，x ± s，n=3）

2.4 各給藥組對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞ROS的影響

計(jì)算結(jié)果分別見(jiàn)表5。從測(cè)量得到的結(jié)果可以看出，四君子湯與生脈飲能夠顯著的增加巨噬細(xì)胞上清液中ROS的含量（P＜0.05）；隨著濃度的增加，ROS 的釋放量逐漸增加，當(dāng)濃度達(dá)到400mg/L時(shí)，釋放量達(dá)到最大，再增加給藥濃度，釋放量出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但是在400mg/L時(shí)，ROS釋放量不存在顯著差異（P＞0.05）；同劑量下，在800mg/L時(shí)，生生脈組與生四君對(duì)巨噬細(xì)胞ROS的影響分別為（533.16±73.88）IU/mL、（629.77±64.66）IU/mL 組存在顯著差異，效果上生四君組優(yōu)于紅四君組，紅生脈組優(yōu)于生生脈組，但各組之間沒(méi)有顯著差異。

2.5 各給藥組對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α的影響

計(jì)算結(jié)果分別見(jiàn)表6。從測(cè)量得到的結(jié)果可以看出，四君子湯與生脈飲能夠顯著的增加巨噬細(xì)胞上清液中TNF-α的含量（P＜0.05）；隨著濃度的增加，TNF-α的釋放量逐漸增加，當(dāng)濃度達(dá)到400mg/L時(shí)，釋放量達(dá)到最大，再增加給藥濃度，釋放量出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，與400mg/L組比較，100和800mg/L有顯著性差異（P＜0.05）；同劑量組與生四君組比較，生生脈組對(duì)TNF-α的影響分別為（18.28±1.53）ng/L、（16.47±1.44）ng/L（P ＜ 0.05）呈顯著性差異，效果上生四君組優(yōu)于紅四君組，紅生脈組優(yōu)于生生脈組。

3 討論

3.1 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅吸光度和增長(zhǎng)率的影響[12]

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各給藥組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力高于空白組， 說(shuō)明生曬參四君子湯、紅參四君子湯、紅參生脈飲和生曬參生脈飲均有顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性，提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力；同時(shí)比較各組數(shù)值，在400mg/L時(shí)增強(qiáng)效果最為明顯，細(xì)胞活性最強(qiáng)，說(shuō)明400mg/L為其最佳濃度，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的作用最強(qiáng)；比較同方劑生熟之間的差異，四君子湯組中生曬參組方數(shù)值上優(yōu)于紅參組方；同時(shí)生脈飲組中，紅參組方在數(shù)值上優(yōu)于生曬參組方，但是生、紅組方間不存在顯著差異。

3.2 各給藥組對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO的影響[13]

巨噬細(xì)胞可釋放NO因子，而NO的一個(gè)最突出的作用是增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)抗病毒、細(xì)菌、真菌、腫瘤細(xì)胞等作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四君子湯與生脈飲能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO，隨著給藥濃度的增加，NO的釋放量逐漸增加，當(dāng)濃度達(dá)到400mg/L時(shí)，釋放量達(dá)到最大，同劑量時(shí)與生四君組比較，400mg/L時(shí)，紅四君組、生生脈組和紅生脈組均低于生四君組。

3.3 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞ROS的影響[14]

需氧細(xì)胞在代謝過(guò)程中產(chǎn)生一系列活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）可雙向調(diào)控某些腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖，并發(fā)現(xiàn)了自由基與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，同時(shí)ROS在啟動(dòng)和維持的再生反應(yīng)中必不可少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四君子湯與生脈飲能夠顯著的增加巨噬細(xì)胞上清液中ROS的含量；當(dāng)濃度為400mg/L時(shí)，ROS 的釋放量達(dá)到最大，說(shuō)明400mg/L為其最佳給藥濃度；同劑量下，在100和800mg/L時(shí)，生生脈組與生四君組存在顯著差異，數(shù)值上生四君組高于紅四君組，紅生脈組高于生生脈組，但各組之間沒(méi)有顯著差異。

3.4 各給藥組對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α的影響[15]

腫瘤壞死因子（TNF-α）是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的，對(duì)免疫系統(tǒng)有強(qiáng)有力的作用，促進(jìn)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四君子湯與生脈飲能夠顯著的增加巨噬細(xì)胞上清液中TNF-α的含量；400mg/L為釋放TNF-α最佳給藥濃度，說(shuō)明在400mg/L時(shí)，細(xì)胞活性達(dá)到最大，比較各組間數(shù)據(jù)，數(shù)值上生四君組高于紅四君組，紅生脈組高于生生脈組。

綜合以上，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，各方劑組在400mg/L時(shí)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的作用最強(qiáng)，同劑量組間生四君、紅生脈效果優(yōu)于替換后的方劑組，說(shuō)明經(jīng)典方劑在使用中的優(yōu)越性與特定性，在使用的過(guò)程中應(yīng)避免將生曬參與紅參互換代替的行為，才能最好的發(fā)揮人參在方劑中的作用。