黃龍花，譚武平，劉遠超，黃志勇，鐘元茂，史 釧，胡惠萍**

（1.廣東省微生物研究所，省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東 廣州 510070；2.廣東粵微食用菌技術有限公司，廣東 廣州 510663）

金針菇隸屬于口蘑科（Tricholomataceae）冬菇屬（Flammulina），含有豐富的大分子物質，如多糖和糖蛋白，具有提高免疫力、抗癌和抗病毒的功效[1-2]，而且味道鮮美，因此成為重要的食（藥）用菌，金針菇已成為工廠化生產(chǎn)的主栽種類。其子實體需要在低溫8℃～14℃條件下生長[3]，工廠化生產(chǎn)因降溫所產(chǎn)生的能耗成本很高，因此，選育適宜高溫生長的金針菇品種，成為金針菇育種的重要研究方向[4-6]。野生金針菇資源的基因型差異為育種提供了豐富的遺傳材料，因此研究野生金針菇種質資源的遺傳多樣性，對今后金針菇育種和菌種知識產(chǎn)權的保護，具有重要的意義。

ITS（internal transcribed spacer）是核糖體DNA上一個非編碼區(qū)，為中度保守序列，在物種進化過程中，受到的選擇壓力較小，允許更多的變異，進化速度很快，因而可以提供大量的變異位點和信息位點[7]。ITS不僅在物種鑒定上廣泛應用，同時也可以對種內差異進行分析[8]。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

所有供試菌種見表1，11個野生分離種采集自全國各自然保護區(qū)，2個市場流通栽培種購自福建某菜市場，13株金針菇菌種都是廣東省微生物所食用菌研究發(fā)展中心采集或購買并分離純化的。

1.2 方法

1.2.1 傳統(tǒng)形態(tài)鑒定

通過肉眼觀察標本的菌蓋、菌褶、菌柄形態(tài)、顏色和附屬物。同時用顯微鏡觀察子實體的微觀特征：選取待觀察的組織，置于5%KOH溶液中觀察擔子、擔孢子、囊狀體、蓋皮層組織的形態(tài)、大小以及顏色反應；參考分類工具書以及新近的研究成果進行形態(tài)學分類鑒定[9-14]。

表1 菌種來源及序列登錄號Tab.1 Species and their GenBank accession number

1.2.2 PDA 培養(yǎng)基

馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨5 g、KH2PO41 g、瓊脂15 g，定容至1 L。

1.2.3DNA 提取

將菌絲接種到貼有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)7 d～10 d后收集新鮮菌絲作為DNA提取材料，使用天根生化科技（北京）有限公司的DP305 DNA提取試劑盒，按說明書操作，得到的基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR 擴增

采用通用引物ITS1和ITS4[15]（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）進行PCR擴增，引物由Sangon公司合成。Taq酶購自Sangon公司。50 μL反應體系：模板DNA 10 ng～100 ng，ITS1（10 μmol·L-1）2 μL，ITS4（10 μmol·L-1）2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，Mg2+（25 mM）3 μL，dNTP（each 10 mmol·L-1）1 μL，Taq DNA Polymerase（5U·μL-1）1 μL，ddH2O補齊到50 μL。擴增程序：94℃預變性4 min；94℃變性30 s；55℃退火45 s；72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。1.2.5 克隆測序及序列分析

PCR產(chǎn)物純化后進行T-A克隆測序，所得序列在NCBI上進行Blast相似性搜索，確定目標序列，根據(jù)GenBank中已報道的金針菇ITS序列（Accession No.DQ978220.1） 和“The ITS2 Database”數(shù)據(jù)庫，確定所有金針菇樣品的rDNA-ITS序列中ITS1和ITS2與3個編碼區(qū)18S、5.8S和28S的界限。去除兩側多余序列，只保留ITS1、5.8S和ITS2用于分析。用Clustal W進行序列比對對齊，MEGA Version 6.0進行序列信息位點的統(tǒng)計分析、遺傳距離計算和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，按照Neighbor-joining法，基于Kimura雙參數(shù)模型，以香菇（Lentinula edodes） 作為外類群，用自展法（Bootstrap，1 000次循環(huán)）檢驗各分支的置信度。

2 結果

2.1 傳統(tǒng)形態(tài)鑒定

傳統(tǒng)形態(tài)學分類鑒定可將13個試驗菌株分為3個菌種：Flammulina rossica，柳生金針菇，也叫淡色冬菇；Flammulina fennae，國內少見記載，目前尚無通用中文名，在本研究中被李泰輝教授命名為“芬娜金針菇”；Flammulina velutipes，金針菇，也叫冬菇、毛柄金錢菌、樸菰等。

2.2 rDNA ITS序列

經(jīng)軟件處理，所有試驗菌株ITS序列信息見表2。13個金針菇樣品的ITS序列（只包含ITS1、5.8S rDNA和ITS2） 長度變化范圍在698 bp～718 bp，相差20 bp，ITS序列最短的菌株是M140658，最長的是S140014。5.8S rDNA長度為156 bp，高度保守，所有樣品只有1個位點的差異，其中E141531、W141696、W141699、N140925在相同位點出現(xiàn)1個AT→CG轉換（transition）。

結果顯示，ITS1序列長度范圍246 bp～250 bp，只相差4 bp，堿基 A占 19.9%，堿基 T占 32.6%，堿基C占25.4%，堿基G占22.1%，各基因型（G+C） 含量差異不大，最低為46.8%，最高為49.6%。當空位（gap）作缺失處理時，ITS1區(qū)全序列排序后的長度為261個位點，最長空位（gap） 相差10 bp，共有35個變異位點（variable sites），占總位點的13.4%，22個簡約信息位點（parsimony informative sites），占總位點的 8.4%。

表2 實驗菌株的ITS序列信息Tab.2 The ITS sequence information of test samples

ITS2序列長度在296 bp～314 bp，相差18個堿基，長度方面ITS1區(qū)變化更大，堿基A占16.1%，堿基 T占 31.4%，堿基 C占 26.3%，堿基 G占26.2%，各基因型（G+C） 含量總體高于ITS1區(qū)域，變幅為 51.7%～53.2%。當空位 （gap） 作缺失處理時，ITS2區(qū)全序列排序后的長度為319個位點，最長空位（gap） 樣品M140658相差15 bp，共有27個變異位點，占總位點的8.5%，17個簡約信息位點，占總位點的5.0%。

2.3 菌株間遺傳距離計算和系統(tǒng)發(fā)育樹構建

2.3.1 遺傳距離

根據(jù)Kimura雙參數(shù)方法計算全國11個野生金針菇和2個栽培金針菇菌株遺傳距離，結果見表3。

由表3可知，13個金針菇種間遺傳距離在0～0.045，其中Flammulina velutipes種內遺傳距離較小（0～0.008），F(xiàn)lammulina rossica 種內遺傳距離較大（0.002～0.014）。而黑龍江日月峽的 Flammulina velutipes與黑龍江五營的Flammulina rossica遺傳距離最大，為 0.045。

2.3.2 系統(tǒng)發(fā)育樹

按照Neighbor-joining法，基于Kimura雙參數(shù)模型，以香菇（Lentinula edodes） 作為外類群，用自展法（Bootstrap，1 000次循環(huán)）檢驗各分支的置信度。將13個金針菇與GenBank上公布的國內外其他金針菇菌株的ITS序列進行比對，分析他們的系統(tǒng)發(fā)育關系，結果見圖1。從圖1可知，所有試驗菌株可以分為3個不同的種：柳生金針菇（Flammulina rossica）、芬娜金針菇（Flammulina fennae）、金針菇（Flammulina velutipes）。Flammulina velutipes以 98%的可信度聚在一起形成一個分支，這一分支與Flammulina rossica和Flammulina fennae組成的單系分支構成姐妹群，其中Flammulina rossica以99%的可信度聚成1個分支，而2個Flammulina fennae以90%的可信度聚成1個分支。

表3 13株金針菇ITS序列的遺傳距離矩陣Tab.3 The genetic distance matrix of ITS sequences of thirteen Flammulina sp.

野生金針菇的地域差異，在系統(tǒng)發(fā)育樹中同樣得到很好的支持。黑龍江采集的E141531、W141696、W141699以81%的可信度聚在一起；四川省采集的E141870、N140864和N140951以87%的可信度聚在一起；湖南莽山的S140014菌株與廣東南嶺的N140982菌株以84%的可信度聚在一起，說明親緣關系很近，遺傳距離為0.002，這是因為湖南莽山和廣東南嶺本就是同一山脈，只因被省界隔開而出現(xiàn)不同名稱；另外，內蒙古采集的M140658單獨構成1個分支。系統(tǒng)發(fā)育樹表現(xiàn)出金針菇的種屬差異和地域差異，說明ITS1-5.8S-ITS2 rDNA可以用于鑒別金針菇的遺傳關系。

3 討論

圖1 基于ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on ITS sequences

在系統(tǒng)學分析中，ITS1或ITS2的序列可作為單獨的片段進行系統(tǒng)發(fā)育分析[16]，但是更多的研究者是將2個片段綜合考慮[17-19]。

本研究中13個金針菇樣品，ITS1-5.8S-ITS2片段長度均在710 bp左右，ITS1和ITS2序列的變異位點數(shù)分別為35個和27個，占總位點的13.4%和8.5%，且ITS1序列的簡約信息位點也多于ITS2序列，分別占總位點的8.4%和5.0%，這表明金針菇ITS1序列變異明顯大于ITS2序列。因此，如果采用單個區(qū)間分別對不同金針菇種進行系統(tǒng)發(fā)育分析，選擇ITS1序列更適合。不同物種間可能存在差異，王化坤[20]的研究發(fā)現(xiàn)桃、李、櫻桃的ITS1序列變異位點高于ITS2序列，而梅的ITS1序列變異位點低于ITS2序列。本研究中，采集到的菌株種類和采集地域有限，在擴大采樣群體后，菌株的信息位點和變異位點都有可能增加。

通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹，種屬差異和地域差異都得到了很好的體現(xiàn)。四川的Flammulina rossica樣品與黑龍江的Flammulina rossica樣品分別聚在2個小分支，四川的樣品采集地均在海拔3 000 m以上，采集時平均溫度在8℃左右，而黑龍江的樣品采集時平均氣溫為20℃左右，有望開發(fā)成耐高溫金針菇品種。內蒙古采集的Flammulina fennae單獨聚在1個分支，目前尚無中文名，因似少女的纖細體型，由李泰輝教授命名為“芬娜金針菇”，經(jīng)馴化發(fā)現(xiàn)，該株金針菇出菇溫度較高，商品性狀好（菌柄細長筆直、長度均勻；菌蓋小而均勻；菌柄基部不粘黏），具有較好的開發(fā)利用價值。野生菌種的遺傳多樣性為金針菇的優(yōu)良新菌種選育提供了豐富種質資源。

4 結論

通過對采自全國7個自然保護區(qū)共計11個野生金針菇和2個常見栽培金針菇菌株，進行ITS-PCR和產(chǎn)物測序。基于ITS序列進行菌株的遺傳距離分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，結果顯示，金針菇的ITS1序列比ITS2序列進化速率快，變異位點和簡約信息位點差異較大；13株金針菇種內遺傳距離為0～0.014，種間遺傳距離為 0.029～0.045；ITS 系統(tǒng)發(fā)育樹支持將13個菌株分為3個類群，且相同菌種地域越近則親緣關系也越近。