田鳳鳴， 陳強， 蘇滿春， 朱秀娟， 聶龍英， 孫杰

(隴南師范高等?？茖W校農(nóng)林技術(shù)學院， 甘肅隴南742500)

引言

京大戟為大戟科(Euphorbiaceace Juss.)大戟屬(Euphorbia L.)植物大戟(E.pekinensisRupr.)的干燥根[1]，收載于歷次版本的《中華人民共和國藥典》，具有瀉水逐飲、消腫散結(jié)的作用[2]。多糖是由單糖縮合而成的多聚物，是一類重要的活性物質(zhì)[3]。研究報道中，植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、降血糖、抗腫瘤等多種生物活性，并且具有毒副作用小和不易造成殘留等優(yōu)點[4-5]，因此逐漸受到研究人員的青睞。

多糖含量測定方法已有很多，有比色法、滴定法、高效液相、氣相色譜法、色譜法、薄層掃描法等[6]。目前比色法已被廣泛應(yīng)用到多糖含量測定中。在多數(shù)文獻報道中，苯酚-硫酸法和蒽酮比色法是主要測定多糖含量的方法[7-9]。一般在多糖樣品較少時，采用蒽酮硫酸法比較合適，但此法的缺點是蒽酮試劑不穩(wěn)定、需臨時配制、穩(wěn)定性較差。而苯酚硫酸法較為穩(wěn)定，為較理想的多糖含量測定方法，因此本文采用苯酚-硫酸法來測定多糖。目前對京大戟多糖的提取條件和含量測定的文獻報道甚少。本文對京大戟多糖的提取條件進行了探索，且對苯酚硫酸法測定多糖的條件進行了研究，以優(yōu)化京大戟多糖的提取條件和多糖含量的測定方法，為其后期的研究提供技術(shù)上的支持。

1儀器與材料

1.1儀器設(shè)備

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；老本行粉碎機(400型，永康市云臻電子)；可見分光光度計(SP-723PC,上海光譜儀器公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52 A，上海亞榮生化儀器廠)；超純水儀(HS1810-2，重慶阿修羅)；分析天平(DV215CD,奧豪斯公司)；離心機(L-500,長沙湘儀離心機公司)。

1.2材料與試劑

京大戟由隴南師專黃兆輝博士采集并鑒定，苯酚、乙醇、濃硫酸、葡萄糖標準品均由西安化玻試劑有限公司提供。

2方法及內(nèi)容

2.1京大戟多糖提取工藝[10]

用粉碎機將干燥的京大戟粉碎成粉末狀，采用熱水浸提法按照“粗多糖的制備-除蛋白-純凈多糖”的提取工藝來制備京大戟多糖。

2.2葡萄糖標液的配制及標準曲線的制備

精確稱取烘干至恒重的葡萄糖1.0 mg，蒸餾水溶解、定容至10 mL。分別取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的葡萄糖標準液于各試管中，加水補足至1 mL，搖勻。在各管中加入1 mL濃度為5%的苯酚，再立即加入5.0 mL的濃硫酸混勻(在冰水浴中進行)；沸水浴30 min，取出迅速冷卻至室溫，在波長490 nm處測定吸光值。以吸光值和對應(yīng)的葡萄糖含量來繪制標準曲線，得到線性回歸方程。2.3京大戟多糖的提取率

稱取2.1中制備的京大戟多糖2.5 mg，蒸餾水溶解并定容至100 mL，從中吸取1 mL，按照2.2的方法，在波長490 nm處測定吸光值，按照標準曲線方程計算出京大戟總糖的含量。京大戟多糖提取率的計算式為[11]：

提取率=V×C×W2/(W3×W1)×f×100%

式中：C由葡萄糖標準曲線方程計算所得京大戟多糖的濃度，g/L；W1為京大戟粉末的質(zhì)量，g；W2為提取的京大戟多糖的質(zhì)量，g；W3為用于測定的京大戟多糖質(zhì)量，g；V為溶解定容后的體積，L；f為校正因子。

2.4京大戟多糖熱水提取條件的優(yōu)化

(1) 液料比：京大戟粉末各稱取5.0 g共7份，在80 ℃溫度下提取2 h，液料比分別選用10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，各提取1次，由京大戟多糖提取率的差異來判斷液料比不同對京大戟多糖提取率的影響；

(2) 提取次數(shù)：分別取5.0 g京大戟粉末共5份，在溫度80 ℃、液料比為30∶1，提取時間為2 h的條件下，分別提取1、2、3、4、5次，由京大戟多糖提取率的差異來分析不同提取次數(shù)對京大戟多糖提取率的影響；

(3) 提取時間：分別稱取5.0 g京大戟粉末共6份，在液料比為30∶1，提取溫度為80 ℃，提取次數(shù)為2的條件下，分別提取1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h，由京大戟多糖提取率的差異比較不同時間對京大戟多糖提取率的影響；

(4) 提取溫度：分別稱取5.0 g京大戟粉末共5份，在液料比為30∶1，提取時間為2 h,提取次數(shù)為2的條件下，分別于70 ℃、75 ℃、80 ℃、90 ℃、95 ℃下提取，由京大戟多糖提取率的差異分析不同溫度對京大戟多糖提取率的影響。

2.5樣品中京大戟多糖含量的計算方法[12]

取1.0 mL濃度為0.3 mg/mL樣液于試管中，加入1.0 mL濃度為5%的苯酚，搖勻，冰浴中加入濃硫酸5.0 mL，混勻，沸水浴30 min，冷卻后在波長490 nm處測定吸光值，由以下公式計算京大戟多糖含量：

多糖含量(%)=(C×D×f)/m×100%

式中：C為樣品中葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；D為京大戟中多糖溶液的稀釋因子；f為校正因子；m為樣品中京大戟的質(zhì)量，mg。

2.6稀釋因子的計算方法

因：C1.V1=C2.V2

故：稀釋因子=C1/C2=V2/V1

式中：V1是從原溶液中移取京大戟多糖的體積；V2是稀釋定容后多糖的體積；C1是原溶液中京大戟多糖的濃度；C2是稀釋定容后多糖的濃度。

2.7計算校正因子[13]

稱取京大戟多糖10.0 mg，蒸餾水溶解定容于50 mL的容量瓶中，取2 mL多糖溶液按照苯酚-硫酸法測定其吸光度，利用回歸方程求出京大戟多糖儲備液中葡萄質(zhì)量的濃度，校正因子f的計算式為：

f=m/C×D

式中：m為稱取多糖的質(zhì)量，mg；C為曲線中求得儲備的葡萄質(zhì)量濃度，mg/mL；D為稀釋因子。

2.8苯酚-硫酸法測定京大戟多糖含量條件的優(yōu)化

(1) 苯酚濃度：按照2.5，其他條件相同，改變苯酚的濃度(1%、3%、5%、7%、9%)，在波長490 nm處測定吸光值，計算多糖含量；

(2) 濃硫酸用量：按照2.5，苯酚的濃度按照確定的濃度，改變濃硫酸體積(3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL)，在波長490 nm處測定吸光值，計算多糖含量；

(3) 反應(yīng)溫度：按照2.5，苯酚的濃度和濃硫酸用量按照確定的條件, 改變反應(yīng)溫度(20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃)，在波長490 nm處測定吸光值，計算多糖含量；

(4) 反應(yīng)時間：按照2.5，苯酚的濃度、濃硫酸用量和反應(yīng)溫度按照確定后的條件,改變反應(yīng)時間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)，在波長490 nm處測定吸光值，計算多糖含量。

2.9苯酚-硫酸法的方法學評價[14]

按照確定的條件，分別依次進行精密度實驗、穩(wěn)定性實驗、重現(xiàn)性實驗以及加標回收率實驗。

2.9.1精密度實驗和重現(xiàn)性

在苯酚-硫酸法的最佳條件下重復(fù)檢測5次京大戟多糖含量，并計算其RSD值。

2.9.2穩(wěn)定性實驗方法

采用最佳的苯酚-硫酸法，每隔2 h對京大戟多糖檢測一次，重復(fù)5次，并計算其RSD。

2.9.3加樣回收率實驗方法

取已知含量的京大戟多糖樣品溶液6份，分別按照100%加入已知含量的葡萄糖標準品溶液，采用苯酚-硫酸法最佳的條件測定其吸光值，并計算加樣回收率。

加樣回收率(%)=(檢測總量-樣品所含量)/加標量×100%

3結(jié)果與分析

3.1葡萄糖標準曲線的制備

如圖1所示，葡萄糖標準曲線方程為：A=0.0023x-0.0018，其中，A為吸光值，x為葡萄糖濃度(ug/mL)，R2=0.9998。由標準曲線得到京大戟多糖含量為58.6%。

圖1葡萄糖標準曲線

3.2京大戟多糖提取條件的確定

各因素對京大戟多糖提取率的影響如圖2所示。由圖2(a)可知京大戟多糖的提取率隨液料比的增加而逐漸提高，這是因為液料比的增大能增加物料與溶劑分子的接觸機會，從而加速了多糖的擴散，在30∶1時提取率達到最大，而再增加液料比例時，其多糖提取率反而降低，因此液料比最佳為30∶1。由圖2(b)可知，隨提取次數(shù)的增加京大戟多糖的提取率也在不斷上升，但當次數(shù)達到2次后，提取率增加緩慢，繼續(xù)增加提取次數(shù)，反而會增加后續(xù)的工作成本，因此確定提取次數(shù)為2次較為合理。由圖2(c)可知，京大戟多糖提取率在2 h內(nèi)隨著時間的增加而迅速提高，超過2 h后增加緩慢，甚至降低，因此最佳提取時間為2 h。由圖2(d)可知提取溫度在70 ℃～85 ℃之間時，京大戟多糖提取率隨溫度的上升而迅速提高，在85℃～95℃之間時又迅速下降，因此京大戟多糖提取的最佳溫度為85℃。

圖2各因素對京大戟多糖提取率的影響

3.3苯酚-硫酸法測定京大戟多糖含量

本文從苯酚濃度、硫酸用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間4個方面來優(yōu)化苯酚-硫酸法測定京大戟多糖的條件。各因素對苯酚-硫酸法測定京大戟多糖含量的影響如圖3所示。由圖3(a)可知苯酚濃度在1%～5%范圍內(nèi)時多糖的吸光值隨苯酚濃度的增加而上升，到5%時吸光值達到最大，再增加苯酚濃度吸光值反而降低，因此確定苯酚的最佳濃度為5%。由圖3(b)可知硫酸用量對多糖測定的影響很明顯，硫酸用量在1 mL～5 mL之內(nèi)時，吸光值隨硫酸用量的增加而增加，當硫酸達到5 mL時吸光值最大，超過5 mL后吸光值反而逐漸減小，因此確定硫酸的用量為5 mL。由圖3(c)可知，隨著反應(yīng)溫度的上升，吸光值不斷增加，當反應(yīng)溫度達到100 ℃時，吸光值最大，因此確定其反應(yīng)的最佳溫度為100 ℃。由圖3(d)可知，反應(yīng)時間在0 min～30 min之內(nèi)時，隨時間的延長其吸光值也在不斷增加，當反應(yīng)時間達到30 min時吸光值達到最大值，超過30 min后吸光值反而不斷降低，因此確定最佳反應(yīng)時間為30 min。以上優(yōu)化的條件將為京大戟多糖后續(xù)的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

圖3各因素對苯酚-硫酸法測定京大戟多糖含量的影響

3.4方法學評價

從表1、表2和表3可知苯酚硫酸法測定京大戟多糖含量的精密度和重現(xiàn)性的相對標準偏差為1.38%，穩(wěn)定性標準偏差為1.78%，加標回收率的標準偏差為1.89%。結(jié)果表明，此方法操作簡單、快速、準確、條件易于掌握，在實驗室可操作。

表1苯酚硫酸法測定京大戟多糖含量的精密度和重現(xiàn)性

表2苯酚硫酸法測定京大戟多糖含量的穩(wěn)定性

表3苯酚硫酸法測定京大戟多糖含量加標回收率

4討論

水提醇沉法是藥材中的有效成分以水作為溶劑進行提取，然后提取液中的雜質(zhì)用不同濃度的乙醇去除[15]。多糖的醇沉效果直接受乙醇濃度的影響[16]。研究報道中，莪術(shù)[17]、白及[18]、山茱萸[19]多糖含量受乙醇濃度的影響較大。同時水的用量、料液比、提取次數(shù)、提取時間及提取溫度，都會影響提取率[20]。因此需對提取條件進行優(yōu)化。

本文對京大戟多糖提取的條件確定為：液料比30∶1，提取次數(shù)2次，提取時間2 h，提取溫度85 ℃；苯酚-硫酸法測定京大戟多糖含量的條件確定為：苯酚濃度為5%，濃硫酸為5 mL，反應(yīng)溫度為100 ℃，反應(yīng)時間為30 min。同時對苯酚硫酸法測定多糖的方法分別進行了精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和加樣回收率實驗，實驗結(jié)果顯示精密度和重現(xiàn)性的相對標準偏差為1.38%，穩(wěn)定性標準偏差為1.78%，加標回收率的標準偏差為1.89%，表明實驗確定的京大戟多糖的提取條件和測定方法的數(shù)據(jù)可靠準確，在實驗室可行，為今后京大戟多糖進一步的研究奠定基礎(chǔ)。