劉長命，王潔

（商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西商洛 726000）

白芨［Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.］又名白給、連及草等，產(chǎn)地主要在我國廣西、貴州、云南、四川、陜西南部等[1]。白芨是蘭科白芨屬的藥用植物，對細菌和其他病原菌微生物均有抑菌和殺菌作用[2]。干燥的白芨塊莖味苦甘澀，性平微寒，歸肺、胃、肝經(jīng)，其功效主要有補肺、消腫、收斂止血、散結逐腐、生肌斂瘡等，被稱為“外科最善”[3]。研究表明，白芨乙醇浸提液可抑制枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、變形球菌、大腸桿菌及人型結核桿菌[4]。目前，在臨床醫(yī)學上，白芨塊莖的藥

用成分較多，但主要為白芨多糖（Bletilla striata polysaccharide，BSP），又稱白芨膠[5]。 據(jù)相關文獻表明，國內研究白芨藥用成分主要集中在中醫(yī)中藥的傳統(tǒng)經(jīng)驗階段，而對其不同方法提取時最優(yōu)提取工藝條件及抗菌活性研究較少，對抗菌消炎、促進傷口愈合、生物安全性等機制方面的研究亟待深入[6-7]。白芨多糖在醫(yī)學研究上有諸多的應用，不僅具有抑菌作用，還是一種優(yōu)良的天然生物黏附材料，在作為藥物載體等方面有其獨特作用，然而對其最優(yōu)提取工藝條件研究還較少[8-9]。本研究通過水提醇沉法對商洛白芨的多糖提取工藝進行優(yōu)化，篩選最優(yōu)的提取工藝條件，并比較云南、貴州與商洛栽培白芨中的白芨多糖含量，為當?shù)匕总纲Y源的進一步開發(fā)利用及栽培引種提供借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料

商洛白芨［Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.］采自商洛市丹鳳縣兩年生栽培，云南、貴州白芨分別為云南文山和貴州赤水的兩年生栽培。

1.2 方法

1.2.1 材料的準備

將新鮮的白芨塊莖流水下洗凈，切片后置于恒溫干燥箱中，42℃烘48 h至無水分即可。將干燥后的白芨塊莖經(jīng)小型粉碎機粉碎后，過80 mm的藥典篩，得白芨粉末。

1.2.2 白芨多糖提取預試驗

準確稱取白芨粉末3 g置于錐形瓶中，加入60 mL的蒸餾水，在80℃水浴鍋中溫育2 h，四層紗布過濾，將濾液收集。濾渣繼續(xù)加水提取2次，將3次提取的濾液合并后，進行旋轉蒸發(fā)濃縮，至原體積的1/3。向濃縮后的濾液中加入Sevager試劑（氯仿：正丁醇=5：1），濾液與Sevager試劑的體積之比為 5：1，充分震蕩搖勻，3500r·min－1離心10 min，取上清液，加入三倍體積的95%乙醇進行沉淀，充分攪拌后，密封，室溫下靜置一夜，抽濾后真空冷凍干燥，得白芨粗多糖。稱重后保存于－20℃冰箱待測。

1.2.3 白芨多糖提取單因素試驗

以料液比（材料質量g/所用溶劑的體積mL）、提取溫度(℃)、提取時間(h)、醇沉濃度(%)為四因素設置四水平的單因素試驗，如表1所示，其余步驟同方法 1.2.2，提取得到白芨粗多糖。

表1 白芨的糖提取單因素試驗設計因素與水平

1.2.4 白芨多糖提取正交試驗

以單因素試驗結果為基礎，篩選出單因素中的料液比、提取溫度、提取時間、醇沉濃度各因素中白芨多糖含量最多的一個水平值，上下取值，其余按1.2.2的步驟進行，得白芨粗多糖。由于在單因素試驗中，醇沉濃度為85%時獲得的白芨多糖含量最高，故綜合考慮后選擇對白芨多糖含量影響相近的料液比、提取溫度、提取時間三個因素進行正交試驗，正交試驗因素水平，見表2。

表2 白芨多糖提取正交試驗設計因素與水平

1.2.5 標準曲線的制作

準確稱取 D-葡萄糖對照品，配置成 2.5 g·L－1標準溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配[10]。分別量取葡萄糖標準溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL 于試管中， 對 應 加 入 0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mL 蒸餾水， 再各加 1 mL 的 5%苯酚溶液、5 mL的濃硫酸，震蕩搖勻后，靜置30 min。以蒸餾水做對照，在490 nm波長下測OD值。以葡萄糖標準溶液濃度（X，μg·mL－1）為橫坐標，以 OD值(Y)為縱坐標，得出線性方程與相關系數(shù)分別為 Y=0.009 8X+0.026 8，R2=0.996 5，表明線性關系良好。

1.2.6 白芨多糖含量的測定

參照雷于國等[11]的方法，將干燥的白芨多糖粉碎后，精密稱取0.01g，加入適量蒸餾水在磁力攪拌器60℃下充分溶解后，定容至100 mL，配成樣品溶液。吸取1 mL樣品溶液于試管中，加入1 mL的5%苯酚溶液，5 mL濃硫酸，震蕩搖勻，靜置30 min，在490 nm波長下測OD值。將OD值代入回歸方程，得其濃度，白芨多糖含量計算公式為：

白芨多糖含量W（%）=(樣品濃度C×樣品定容后的體積V/樣品的質量m)×100

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對白芨多糖含量的影響

取4個錐形瓶，各加入5 g白芨粉末，再分別加入 75、100、125、150 mL 蒸餾水，80 ℃提取2 h后重復提取兩次，三次重復。其余操作同方法 1.2.2，結果見表3。

表3 料液比對白芨多糖含量的影響

由表3可知，隨著料液比的增加，多糖含量逐漸降低，料液比1：15與其他組達顯著性差異水平。雖然料液比為1：30時多糖含量較料液比為1：25有顯著升高，但仍顯著低于料液比為1：15的含量，且其提取得率也低。綜合考慮后續(xù)濃縮、醇沉等工藝，取料液比1：15為最佳條件。

2.1.2 溫度對白芨多糖含量的影響

取4個錐形瓶，各加入5 g白芨粉末和100 mL蒸餾水，分別在60℃、70℃、80℃、90℃下提取2 h，重復提取兩次，三次重復。其他操作同方法1.2.2，結果見表4。

表4 溫度對白芨多糖含量的影響

由表4可知，隨著溫度的提高，多糖含量不斷降低，提取溫度60℃時獲得的白芨多糖在同因素中最多，與提取溫度80℃和90℃呈顯著性差異，且其得率也最高。因而，白芨多糖的最佳提取溫度選擇60℃。

2.1.3 提取時間對白芨多糖含量的影響

取4個錐形瓶，各加入5 g白芨粉末和100 mL蒸餾水，80 ℃下分別提取 1.5、2、2.5、3 h，重復提取兩次，設三次重復。 其他操作同方法 1.2.2，結果見表5。

表5 提取時間對白芨多糖含量的影響

由表5可知，隨著提取時間的延長，白芨多糖含量呈降低趨勢，提取1.5 h與3 h的多糖含量達顯著性差異水平，得率也最高，而與2 h和2.5 h差異不顯著。分析其原因可能是由于隨著提取時間的增加，致使較多雜質成分的溶出。因而，綜合考慮確定1.5 h為最佳提取時間。

2.1.4 醇沉濃度對白芨多糖含量的影響

取4個錐形瓶，各加入5 g白芨粉末和100 mL蒸餾水，80℃下加熱2 h，重復提取兩次，合并提取液，濃縮至原體積的1/3，除去雜蛋白后，分別用65%、75%、85%、95%乙醇沉淀過夜，三次重復。 其他操作同方法 1.2.2，結果見表6。

表6 醇濃度對白芨多糖含量的影響

由表6可知，不同的醇沉濃度對白芨多糖含量影響較大，以85%的醇濃度沉淀所獲得的多糖含量最高，顯著高于其他各組。而其得率又低于其他醇濃度，尤其是顯著低于95%醇濃度的多糖得率。綜合考慮，確定醇沉淀濃度為85%。

在進行白芨多糖單因素提取的過程中，主要考慮白芨多糖的含量，而白芨多糖的得率在工業(yè)生產(chǎn)方面也是需要考慮的重要方面。因而本研究的單因素采用了以多糖含量為主，提取得率為輔的方法進行白芨多糖含量的最佳提取條件優(yōu)選。單因素試驗確定的白芨多糖提取最優(yōu)條件為：料液比為 1：15，提取溫度 60 ℃，提取時間 1.5 h，醇沉濃度為85%。

2.2 正交試驗優(yōu)化提取工藝

2.2.1 白芨多糖提取的正交試驗結果

以影響白芨多糖含量相近的3個因素即料液比（g：mL）、提取溫度（℃）、提取時間（h）為優(yōu)選因素，每個因素下設定三個水平進行正交試驗，結果見表7。

表7 白芨多糖提取的正交試驗設計及結果

通過表7直觀分析表明，各因素對白芨多糖含量的影響大小為B>A>C，即提取溫度>料液比>提取時間。從試驗數(shù)據(jù)上得出理論上最佳提取條件為A3B3C1，即料液比1：20，提取溫度70℃，提取時間1 h。但通過L9（33）正交試驗結果（表8）及相關資料表明，在9組試驗中的第9組，白芨多糖的提取條件為A3B3C2，即料液比為1：20，提取溫度為70℃，提取時間為1.5 h為正交試驗中的最佳提取條件。

表8 白芨提取多糖含量正交試驗的極差分析

2.2.2 驗證試驗

為進一步確定更適宜的白芨多糖提取工藝條件，將理論上最佳提取工藝與正交試驗中最佳工藝進行對比驗證。

通過表9可以直觀看出，理論上最佳提取工藝的白芨多糖得率和含量均比正交試驗中最佳提取工藝的要高，多糖得率高出了5.133%，多糖含量高出6.734%。因而，經(jīng)過驗證試驗得出白芨多糖提取最佳工藝條件為A3B3C1，即料液比1：20，提取溫度70℃，提取時間1 h。

表9 理論與正交試驗最佳白芨多糖提取工藝的驗證結果

2.3 不同產(chǎn)地白芨多糖含量比較

分別稱取來自陜西商洛、云南文山和貴州赤水的白芨材料粉末3 g，按料液比1：20加入60 mL蒸餾水，70℃下加熱提取1 h，過四層紗布得濾液，再重復提取兩次，合并濾液，濃縮，除蛋白，85%乙醇醇沉過夜，其余操作同方法 1.2.2，比較結果見圖1。

由圖1可知，利用優(yōu)化的工藝條件所提取的白芨多糖在云南文山白芨中含量最高，達75.22%，其次是陜西商洛白芨，為 57.98%，貴州赤水白芨的含量最低，為54.92%。三個地區(qū)的白芨多糖得率相差均不超過1%，表明該優(yōu)化工藝條件適宜于白芨多糖的提取。

圖1 不同產(chǎn)地白芨多糖含量比較

3 討論與結論

張雪嬌等[12]利用加熱煮沸回流法提取白芨膠中糖含量達75.1%，本研究通過單因素和正交試驗方法確定的白芨多糖提取的最優(yōu)工藝條件得到的結果與其類似，即料液比1：20，提取溫度70℃，提取時間1 h，白芨多糖含量可達75.22%。而趙會然等[13]對云南部分蘭科植物多糖提取工藝研究認為，以40倍水70℃加熱提取2 h后，加適量95%乙醇在4℃下醇沉12 h為蘭科植物多糖的最佳工藝條件，并且重復性好。常影等[14]認為粗葉懸鉤子根多糖提利用水提醇沉法以溫度90℃，時間2 h，料液比1：15效果最好。本研究利用不同醇濃度沉淀時發(fā)現(xiàn)，95%醇溶液可獲得較高的多糖得率，但多糖含量卻顯著低于85%的醇濃度，分析可能是由于醇沉的時間及溫度所導致，或是不同白芨多糖在不同的醇沉濃度下分離出來的分子量不同而異[15-16]。

本研究所得的最佳工藝條件為料液比1：15，提取溫度70℃，提取時間1 h，這與趙會然等[13]對云南部分蘭科植物多糖提取的研究結果相似，因提取溫度在幾個因素中影響最大，而這兩個研究結果均為70℃；本研究而與趙寧等[3]對白芨多糖以料液比 1：10在 90℃提取 1.5 h的結論不同，原因是在多糖的提取過程中，實驗材料的來源、醇沉時的濃度以及實驗前的處理不同，也將影響其研究結果。

在白芨多糖提取過程中，提取方法較多，但各有利弊。韓欣等[17]對白芨多糖提取方法討論中提到溶劑提取法不需特殊設備、成本低，是最常用方法。趙會然等[13]在白芨多糖提取方法認為采用超聲波輔助提取時，多糖得率與熱水提取相當，純度也相近，加大超聲功率有助于多糖釋放溶出，但因超聲波對多糖鏈存在一定破壞，故還原糖含量也隨之升高；醇水提取雖成本較水提高，但因在提取前將醇溶性雜質除去，有效提高多糖純度，減少后期純化步驟。因而本研究采用了水提醇沉法提取白芨多糖，不僅提取率較高，也較方便，成本也較低。

同時，本研究通過比較不同產(chǎn)地栽培白芨的多糖含量發(fā)現(xiàn)，云南文山的白芨多糖含量最高，達75.22%，商洛白芨的多糖含量低于云南白芨，為 57.98%，貴州白芨的多糖含量最低，為54.92%。而劉長命等[18]利用超聲波輔助提取法對三個不同產(chǎn)地的野生白芨多糖含量研究表明，商洛野生白芨的多糖含量最高，達78.87%，表明商洛地區(qū)的野生白芨具有較高的開發(fā)利用價值，但在引種栽培方法方面還有待于提高。