林天寶，劉 巖，計東風，朱 燕，魏 佳，呂志強

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑研究所，浙江 杭州 310021）

桑樹是一種重要經(jīng)濟林木，在食品、醫(yī)藥保健、繭絲綢和生態(tài)等領(lǐng)域都具有重要作用［1～2］。長期以來，桑樹主要通過雜交和多倍體育種方式進行品種改良，雖然已經(jīng)選育多個優(yōu)良品種，但由于桑樹生長周期長，遺傳雜合性高，傳統(tǒng)的育種方法往往需要花費漫長時間，并且很難做到對有價值遺傳性狀的定向育種［3～5］。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，導(dǎo)入優(yōu)良的外源基因，將有利于定向提高桑葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，增強桑樹抗病性和抗逆性的研究［5～8］。桑樹上最早的轉(zhuǎn)基因報道是日本學(xué)者Machii等［9］利用農(nóng)桿菌LBA4404浸染桑樹葉片，誘導(dǎo)獲得GUS組織化學(xué)染色陽性的不定芽。此后，陸小平等［10～11］對桑樹幼苗子葉腋隙進行刺傷，接種感染工程農(nóng)桿菌，利用GUS基因、Km記恨做探針的檢測到較強的雜交信號；王洪利等［12］利用桑樹莖尖的轉(zhuǎn)化法報道由初步研究結(jié)果。Vibha［13］在印度桑（Morus indica L.cv.K2）中過表達大麥（barley）胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白家族成員HVA1，證實轉(zhuǎn)基因植物耐旱、耐鹽和抗寒性都得到改善［14～15］。2011 年，Manaswini等將Osmotin蛋白基因轉(zhuǎn)入K2印度桑中，轉(zhuǎn)基因植物對干旱、鹽脅迫以及真菌脅迫表現(xiàn)出更強的耐受性［16］。然而除印度桑外，其他關(guān)于桑樹轉(zhuǎn)基因研究的報道仍相對較少，特別是國內(nèi)實用果桑品種的遺傳轉(zhuǎn)化方面。西南大學(xué)李鎮(zhèn)剛等人［17］利用花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法進行了研究；以及近年陸續(xù)有報道利用桑樹轉(zhuǎn)基因毛狀根的誘導(dǎo)和繁殖方法、病毒介導(dǎo)的基因沉默的研究探索等；但總體上，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行桑樹遺傳育種的研究尚處于起步階段，還亟需開展更多地探索和研究。

為此，本文選擇萌動期的桑樹冬芽，以注射方法轉(zhuǎn)化攜帶β-glucuronidase（GUS）和卡那霉素（Kan）報告基因的重組農(nóng)桿菌，對冬芽處理枝條的葉片進行GUS酶活性染色和特異性片段的PCR擴增鑒定，以及果實的GUS染色、桑種子的卡那霉素抗性篩選研究。結(jié)果證實通過該方法能篩選到陽性轉(zhuǎn)基因桑樹植株，這為今后開展桑樹功能基因研究和品種改良選育提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

攜帶β-葡萄糖甘酸酶基因（GUS）和抗卡那霉素（Kan）報告基因的根癌農(nóng)桿菌菌株（GV-pBI121）由浙江省農(nóng)科院沈國新研究員惠贈。所含標記基因GUS受花椰菜花葉病毒的35S啟動子控制。

1.2 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)

取保存菌種接種在含有卡那霉素（Kan 100 mg·L-1）和利福平（Rif 50 mg·L-1）兩種抗生素的LB培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，挑取單菌落，接種于含有卡那霉素（50 mg·L-1）和利福平（50 mg·L-1）的液體LB培養(yǎng)基，置28℃恒溫下震蕩培養(yǎng)（200 r·min-1）至菌液濃度（OD600=0.5）時備用。

1.3 供試桑樹品種及浸染轉(zhuǎn)化

試驗用臺灣果桑品種72C002由本課題組基地栽培和保存。選擇冬芽即將萌發(fā)前作為微注射轉(zhuǎn)染時期。取上述菌液，室溫離心15 min（4000 r·min-1）。棄上清，用等量體積的浸染緩沖液（MES 0.25g·L-1，Myo-inositol 0.10g·L-1，MS with Gamborg Vitamins 2.22g·L-1，L-glutamine 0.20g·L-1，D-galactose 1.80g·L-1，pH 5.0）懸浮農(nóng)桿菌。利用1 ml注射器將農(nóng)桿菌浸染液注射入桑樹冬芽，每芽0.1 mL。注射完成后，取鋁箔紙包住枝條，暗處理48 h后，剝離鋁箔紙，繼續(xù)培養(yǎng)。分別采集農(nóng)桿菌注射后枝條生長的葉片、桑果和桑種子做后續(xù)檢測分析。

1.4 GUS酶活性顯色

GUS酶活檢測方法參照文獻［18］，取檢測樣品置于X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄醛酸）染色液（phosphate buffer 50 mmol·L-1，pH 7.0，F(xiàn)errocyanide 3 mmol·L-1，F(xiàn)erricyanide 3mmol·L-1，Triton X-100 0.2 mmol·L-1，X-Gluc 2 mmol·L-1）中，真空泵反復(fù)抽氣3次后，置于37恒溫箱染色過夜。然后棄去染色液，加入70%乙醇脫去樣品葉綠素，觀察并記錄樣品染色結(jié)果。

1.5 DNA抽提及GUS基因的擴增

利用Omega植物基因組抽提試劑盒提取桑樹葉片、對照植株葉片的DNA，分別作為PCR反應(yīng)的模板。根據(jù)GUS基因核苷酸序列設(shè)計一對引物（GusF：5‘-CGT CCT GTA GAA ACCCCA ACCC-’；GusR：5‘-ATGCCATGTTCATCTGCCCAGT-3’）。根據(jù)KOD-Plus-Neo（TOYOBO公司，日本）酶說明，配制PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min后，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s。共循環(huán)35次。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外燈下觀察、拍照。

回收瓊脂糖凝膠上對應(yīng)大小的特異性條帶，并委托上海鉑尚生物技術(shù)公司進行測序檢測。

1.6 冬芽處理組桑果的檢測

采摘冬芽處理枝條上結(jié)出的桑果，收集桑種子并烘干。用100 g·L-1次氯酸鈉對桑籽進行消毒處理［19］后播種于含 100 mg·L-1的Kan 1/2 MS 培養(yǎng)基上。觀察并統(tǒng)計種子的萌發(fā)情況

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS的平均數(shù)單因素方差分析方法，對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹冬芽的轉(zhuǎn)化

以萌動期桑樹72C002的冬芽為研究對象（圖1A），經(jīng)70%酒精擦拭消毒后，每個冬芽注射重組農(nóng)桿菌0.1 ml（圖1A，1B）。一周后，觀察芽尖開始轉(zhuǎn)綠（圖1C）；繼續(xù)觀察至第三周時，芽尖上新葉長大，開始逐漸伸展張開。這時觀察到由于受注射農(nóng)桿菌的影響，葉片葉尖和部分有萎黃卷曲表型出現(xiàn)（圖1D）。

圖1 注射浸染桑樹冬芽及芽頭早期的生長Figure 1 Progress of mulberry winter bud injection and its initial growth

2.2 PCR擴增檢測

冬芽處理8周后，隨機從6個冬芽生長的枝條上采葉片，抽提取樣品DNA后，利用GUS基因特異性引物進行擴增。從PCR的擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果（圖2）可知，有四組樣品擴增到預(yù)計大小條帶，另外2個處理后的葉片樣品僅擴增得到非特異性的雜帶；同時，正常未處理對照植株來源的葉片樣品檢測，擴增均未獲得與GUS基因大小相對應(yīng)的片段。擴增產(chǎn)物純化后送鉑尚公司測序，證實擴增序列與目標基因GUS一致。

圖2 轉(zhuǎn)基因桑樹葉片的PCR擴增檢測Figure 2 PCR measurement of the leaves of transgenic mulberry

圖3 轉(zhuǎn)基因桑樹葉片和果實的GUS染色觀察Figure 3 GUS staining of the leaves and fruits from transgenic mulberry tree

圖4 轉(zhuǎn)基因桑樹種子的抗性篩選Figure 4 Resistance selection of transgenic mulberry seeds

2.3 冬芽處理枝條的GUS酶活性檢測

隨機選取20個注射冬芽長出的枝條，分別采集靠近枝頂端已經(jīng)完全張開的葉片，進行GUS染色。其中有9個枝條上葉片呈現(xiàn)出GUS酶著染的藍色結(jié)果，主要顯示在葉片葉脈附近（圖3A，3B）。

采摘不同冬芽枝條上結(jié)的桑果10個進行GUS酶活性染色，在其中2個桑果上觀察到GUS的表達主要在果柄和部分果肉細胞（圖3C，3D）。

2.4 桑籽的抗性篩選

采集GUS染色陽性10個枝條上的桑果，同一冬芽來源的枝條上的桑果混合在一組，流水反復(fù)沖洗收集桑籽后，將采集好的桑籽置于30℃烘箱烘干。經(jīng)消毒后散播在含100 g·L-1卡那霉素的1/2 MS培養(yǎng)平板上，25℃恒溫培養(yǎng)10天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同組間發(fā)芽率（圖4）從0～16.67%不等，平均7.61%，組間偏差極顯著（P＜0.01）。

3 討論

目前，非轉(zhuǎn)基因的桑樹育種方法在生產(chǎn)應(yīng)用廣泛，人們利用這些傳統(tǒng)的雜交、嫁接、多倍體誘導(dǎo)等技術(shù)，已選育出很多性能優(yōu)良的實用化品種。但為了加快品種選育速度，提高選育的針對性，桑樹轉(zhuǎn)基因技術(shù)的探索一直備受關(guān)注［14］。本研究中，我們采用注射方法將重組農(nóng)桿菌導(dǎo)入桑樹冬芽，對轉(zhuǎn)基因桑樹的GUS酶活性染色、特異性外源基因片段的擴增和抗性篩選檢測外源基因已經(jīng)進入轉(zhuǎn)基因桑樹（圖2～4），GUS陽性檢測率達45%；抗性篩選獲得的轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)率平均為7.61%。但研究還同時發(fā)現(xiàn)，GUS染色檢測陽性率與基因組DNA進行的PCR反應(yīng)率間陽性率不一致，推測這可能與檢測樣本間差異以及檢測方法的靈敏度不同有關(guān)。

本研究針對不同轉(zhuǎn)化枝條獲得桑籽的抗性篩選發(fā)芽率差異較大（圖4），已發(fā)芽的幼苗葉片抽提基因組DNA進行的PCR反應(yīng)卻未擴增到靶片段。分析可能與樓程富等［20］研究提出的未經(jīng)愈傷處理的新芽組織很難被T-DNA整合有關(guān)，因為農(nóng)桿菌很難穿過角質(zhì)層和排列緊密有序的表皮細胞去完成貼壁反應(yīng)。Machii等［21］1996年利用基因槍轟擊桑樹懸浮愈傷組織，研究檢測到GUS陽性，但最終并未能獲得轉(zhuǎn)基因植株。

在農(nóng)桿菌浸染桑樹品種的選擇上，已報道的桑樹轉(zhuǎn)基因主要有新一之瀨、豐馳桑、白桑M5［3］、印度桑 K2［14，16］，不同桑樹品種的遺傳轉(zhuǎn)化適應(yīng)性存在差異；縱使在組織培養(yǎng)時，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)適合川桑、滇桑、藥桑、印度桑無菌幼苗莖段和生根培養(yǎng)體系存在差異，并且培養(yǎng)基中激素濃度小幅變化都會對其繁殖系數(shù)造成明顯影響［22］。這些都提示今后可以利用更多的桑樹品種來進一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系；但本研究方法操作簡單，這對今后桑樹實用品種的遺傳研究具有意見借鑒參考意義。