張椿浩， 劉慶帥， 薛曉曉， 秦 棟， 霍俊偉

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院/農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

黑穗醋栗(RibesmigrumL.)別稱黑加侖，俗稱黑豆，屬虎耳草科(Saxifragaceae)茶藨子屬[1]，非常適宜寒地栽培，在我國已有百年的栽培史，迄今是黑龍江省的特色漿果樹種之一[2]。黑穗醋栗果實中含有多種類黃酮、氨基酸、礦物質(zhì)(其中Ca含量為水果之最)、醇類、酯類以及維生素(富含大量維生素A、B、C和B3)[3]。其中所含維C含量居我國現(xiàn)有野生漿果資源之首，有“維C王果”的美譽[4]。果汁中含有能夠阻斷強致癌物質(zhì)亞硝基嗎啉合成的物質(zhì)，具有一定抑制癌細(xì)胞的作用。黑穗醋栗籽中的γ-亞麻酸是人體必需脂肪酸之一，具有降血脂作用，并且它可通過減少前列腺素E2的產(chǎn)生可減輕炎癥反應(yīng)[5]。黑穗醋栗色素屬于花色苷類，在食品、醫(yī)藥、日用化學(xué)工業(yè)上有著廣闊的應(yīng)用前景[6]。

黑穗醋栗作為寒地小漿果的代表樹種，黑龍江種植面積較大，產(chǎn)量可以占到全國的75%左右[7]。但是在實際生產(chǎn)中，黑龍江地區(qū)黑穗醋栗種植常伴有“二次萌發(fā)”現(xiàn)象，嚴(yán)重威脅產(chǎn)業(yè)發(fā)展。二次萌發(fā)現(xiàn)象發(fā)生在8月，黑龍江地區(qū)有短暫的溫度驟升階段，有研究表明短暫的高溫處理會解除果樹休眠[8-10]，而此時的芽再次萌發(fā)使樹勢遭到破壞，樹體營養(yǎng)嚴(yán)重流失，影響翌年產(chǎn)量。前人在研究過程發(fā)現(xiàn)楊樹的芽季節(jié)性休眠中會發(fā)生細(xì)胞壁加厚、阻斷胞間連絲影響細(xì)胞間聯(lián)系的現(xiàn)象，從而起到促進(jìn)休眠發(fā)生的作用[11]。冬小麥在春化解除休眠過程中，莖尖細(xì)胞發(fā)生了核膜孔開放，線粒體數(shù)量增加等現(xiàn)象[12]。這都說明了植物解除休眠進(jìn)程與細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有著相應(yīng)的關(guān)系，但研究大多集中在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與春季萌發(fā)方面，二次萌發(fā)相關(guān)研究卻甚少。有關(guān)黑穗醋栗二次萌發(fā)的調(diào)控，筆者所在課題組已進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)25 mg/L GA3可明顯促進(jìn)二次萌發(fā)，而50 mg/L ABA則會抑制二次萌發(fā)的發(fā)生[13]。本試驗以黑穗醋栗不易二次萌發(fā)品種黑豐和易二次萌發(fā)品種亞德為試驗材料，從細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)入手，通過不同激素處理比較芽細(xì)胞的特征變化，以期從細(xì)胞學(xué)角度揭示二次萌發(fā)現(xiàn)象的機(jī)理，為全面揭示黑穗醋栗二次萌發(fā)的機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)，為人工調(diào)控黑穗醋栗二次萌發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2015年8月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑穗醋栗種質(zhì)資源圃進(jìn)行，選擇8年生生長勢相對一致的黑豐和亞德各15株，試材常規(guī)管理，長勢中庸。黑豐屬于我國自己選育品種，自然條件下不易二次萌發(fā)，亞德是從俄羅斯引進(jìn)品種，具有易二次萌發(fā)的特性。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗處理 配制30 mg/L GA3、50 mg/L ABA，以清水處理為對照，在果實采收后開始處理，于2015年8月12日進(jìn)行第1次采樣，作為取樣空白對照。從8月13日開始，連續(xù) 3 d 對黑豐植株進(jìn)行處理，噴施GA3、ABA和清水各5株，葉片滴水為止，然后剪取1年生枝條帶回試驗室，將芽剝離并進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)試驗觀察固定。從8月16日開始觀察芽的形態(tài)學(xué)，在芽萌發(fā)的各個時期取1年生枝條的芽進(jìn)行固定，用于超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.2.2 透射電鏡觀察 將取回的芽修成1 mm×3 mm大小，用2.5%戊二醛固定2 h，然后用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值 6.8)漂洗3次，再用1%鋨酸固定液固定2～3 h，用 0.1 mol/L 磷酸緩沖液再漂洗3次。在4 ℃冰箱中按濃度梯度為50%、70%、90%、100%的乙醇分別進(jìn)行15～20 min的脫水處理，后在室溫下用100%丙酮進(jìn)行5～10 min的脫水處理。用純丙酮和包埋液在室溫下進(jìn)行浸透，次日包埋。待包埋液聚合后修塊，用ULTRACUT-E超薄切片機(jī)切成50～60 nm 的薄片，再用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科技中心電鏡室內(nèi)通過H-7650X型透射電鏡觀察并拍片。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豐芽內(nèi)超微結(jié)構(gòu)特征及變化

2.1.1 清水處理下黑豐芽內(nèi)超微結(jié)構(gòu)特征及變化 不易二次萌發(fā)品種黑豐在清水處理下芽內(nèi)超微結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生顯著變化。選擇處理前(8月12日)、處理后3 d(8月17日)和處理后9 d(8月21日)進(jìn)行對比分析，8月12日采集的芽處于質(zhì)壁分離狀態(tài)，細(xì)胞中游離淀粉粒，液泡中有電子致密物質(zhì)，未觀察到有線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞間連絲出現(xiàn)(圖1-1)。8月17日采集的芽仍處于質(zhì)壁分離狀態(tài)，可清晰觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，并且結(jié)構(gòu)分化很完整；未觀察到有胞間連絲出現(xiàn)(圖1-2)。8月21日采集的芽細(xì)胞中質(zhì)壁分離現(xiàn)象已經(jīng)消失，大部分細(xì)胞已經(jīng)形成中心大液泡，部分細(xì)胞液泡中仍有電子致密物質(zhì)未分解；細(xì)胞中游離著淀粉粒未分解，可以清晰觀察到線粒體存在，并且結(jié)構(gòu)分化很完整；未觀察到胞間連絲(圖1-3)。

2.1.2 GA3處理下黑豐芽內(nèi)超微結(jié)構(gòu)特征及變化 不易二次萌發(fā)品種黑豐在GA3處理下芽內(nèi)超微結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的變化。選擇處理前(8月12日)、處理后3 d(8月17日)和處理后7 d(8月21日)進(jìn)行對比分析，8月12日采集的芽處于質(zhì)壁分離狀態(tài)。8月17日采集的芽細(xì)胞質(zhì)壁分離現(xiàn)象已經(jīng)消失，中心大液泡基本形成，液泡中的電子致密物質(zhì)已經(jīng)分解；可以觀察到細(xì)胞中存在較大體積的淀粉粒，線粒體結(jié)構(gòu)明顯，體積較大；觀察細(xì)胞壁可發(fā)現(xiàn)胞間連絲分化，細(xì)胞壁周圍有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在(圖1-4、圖1-5)。8月21日采集的芽細(xì)胞中心大液泡已經(jīng)形成，細(xì)胞質(zhì)中游離少量淀粉粒，淀粉粒與17日相比體積明顯變?。痪€粒體體積減小，但數(shù)量增加；可以觀察到胞間連絲(圖1-6)。

2.1.3 ABA處理下黑豐芽內(nèi)超微結(jié)構(gòu)特征及變化 不易二次萌發(fā)品種黑豐在ABA處理下芽內(nèi)超微結(jié)構(gòu)發(fā)生較大的變化。選擇處理前(8月12日)和處理后7 d(8月21日)進(jìn)行對比分析，8月21日采集的芽細(xì)胞處于質(zhì)壁分離狀態(tài)；液泡中存在較多電子致密物質(zhì)；淀粉粒數(shù)量較多，且體積較大；可以觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在；線粒體和胞間連絲未發(fā)現(xiàn)(圖1-7)。

2.2 亞德芽內(nèi)超微結(jié)構(gòu)特征及變化

2.2.1 清水處理下亞德芽內(nèi)超微結(jié)構(gòu)特征及變化 易于二次萌發(fā)品種亞德在清水處理下芽內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化明顯。選擇處理前(8月12日)、處理中(8月14日)和處理后14 d(8月26日)進(jìn)行對比分析，結(jié)果表明，8月12日采集的芽細(xì)胞并沒有發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象；液泡占據(jù)細(xì)胞大部分體積；細(xì)胞中游離許多體積較小的線粒體；此時并未發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞間連絲結(jié)構(gòu)(圖2-1)。8月14日細(xì)胞中液泡體積進(jìn)一步增加，線粒體結(jié)構(gòu)更加完整，體積變大；此時仍未觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞間連絲出現(xiàn)(圖2-2)。8月26日細(xì)胞形成中心大液泡；淀粉粒消失，線粒體數(shù)量減少，體積明顯增大，可以觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞間連絲(圖2-3)。

2.2.2 GA3處理下亞德芽內(nèi)超微結(jié)構(gòu)特征及變化 8月12日芽細(xì)胞內(nèi)各類細(xì)胞器均存在，并未發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖2-1)。8月14日細(xì)胞液泡通過水合作用逐步擴(kuò)大；線粒體結(jié)構(gòu)清晰，體積增大；可清楚觀察到胞間連絲(圖2-4)。8月21日細(xì)胞分化出細(xì)胞核，可以觀察到核仁的存在；細(xì)胞中形成了單獨的大液泡；淀粉粒數(shù)量明顯減少，線粒體數(shù)量進(jìn)一步增加，體積變大；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)在細(xì)胞壁附近(圖2-5)。8月29日亞德已完全二次萌發(fā)，芽細(xì)胞已經(jīng)形成中心大液泡，細(xì)胞核分解消失；細(xì)胞壁周圍分布了豐富的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，胞間連絲對胞間聯(lián)系起到了積極作用(圖2-6)。

2.2.3 ABA處理下亞德芽內(nèi)超微結(jié)構(gòu)特征及變化 ABA處理下亞德芽內(nèi)超微結(jié)構(gòu)并未發(fā)生明顯變化。8月14日亞德芽細(xì)胞發(fā)生了部分質(zhì)壁分離，并且淀粉粒體積較大；線粒體數(shù)量較多，但體積較小(圖2-7)。8月26日亞德芽細(xì)胞處于質(zhì)壁分離狀態(tài)，淀粉粒已消失；細(xì)胞形成中心大液泡；線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量與之前相比明顯減少(圖2-8)。

3 討論

黑穗醋栗富含多種維生素、糖類和有機(jī)酸，是制作果醬、果酒、飲料等不可或缺的原料。我國目前的栽培面積已有 5 000 多hm2[14]，但黑龍江地區(qū)在實際生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的二次萌發(fā)現(xiàn)象嚴(yán)重影響了產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。筆者所在課題組前期通過試驗已證明GA3和ABA可有效調(diào)控黑穗醋栗二次萌發(fā)現(xiàn)象[13]，但黑穗醋栗二次萌發(fā)的研究機(jī)理尚不清楚，尤其是細(xì)胞學(xué)方面。黑豐作為我國自主選育品種，具有不易二次萌發(fā)的優(yōu)良特性，本試驗通過激素處理，利用電鏡觀察芽的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，以期從細(xì)胞學(xué)角度解釋二次萌發(fā)的發(fā)生機(jī)理。

黑豐作為不易二次萌發(fā)的黑穗醋栗品種，在黑龍江地區(qū)具有較強的種植優(yōu)勢。亞德作為從俄羅斯引進(jìn)品種，具有早熟等優(yōu)良性狀，但在秋季易發(fā)生二次萌發(fā)。本試驗通過GA3與清水處理的對比、ABA與清水的對比發(fā)現(xiàn)，GA3可有效促進(jìn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象消失；而ABA則恰恰相反。丁小余等指出，細(xì)胞在休眠期普遍發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象，說明GA3可以促進(jìn)黑穗醋栗打破休眠，從而促進(jìn)二次萌發(fā)，ABA則是起抑制作用[15]。黃義江等對5個蘋果屬果樹品種抗寒性的研究中指出，質(zhì)壁分離現(xiàn)象與胞間連絲關(guān)系密切，當(dāng)質(zhì)壁分離時胞間連絲相應(yīng)中斷，二者成正比關(guān)系[16]。不易二次萌發(fā)的黑豐進(jìn)行GA3處理，可以在芽細(xì)胞中觀察到胞間連絲出現(xiàn)，而清水和ABA處理黑豐均未發(fā)現(xiàn)胞間連絲分化。對易于二次萌發(fā)的亞德進(jìn)行ABA處理，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞未分化胞間連絲。與黑穗醋栗二次萌發(fā)情況相對應(yīng)，總結(jié)出只有細(xì)胞分化出胞間連絲黑穗醋栗芽才可萌發(fā)。研究指出，崇明水仙頂端生長點進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，在營養(yǎng)生長期胞間連絲處于“通路狀態(tài)”；休眠期間胞間連絲會被電子致密物質(zhì)堵塞；隨休眠解除，電子致密物質(zhì)會逐漸分解，胞間連絲回復(fù)暢通[17]。Jian等通過研究推測胞間連絲是否通暢可作為休眠或解除休眠一種響應(yīng)機(jī)制[18]。本試驗并未觀察到胞間連絲的閉塞狀態(tài)，但激素處理具有鮮明對比，誘導(dǎo)胞間連絲分化可加強細(xì)胞間聯(lián)系，從而起到誘導(dǎo)黑穗醋栗二次萌發(fā)的效果。由此可看出，胞間連絲是黑穗醋栗能否二次萌發(fā)的關(guān)鍵所在。

每個植物細(xì)胞均有形成胞間連絲的潛在能力，通過胞間連絲的轉(zhuǎn)運功能，因此完整植物可以看成一個共質(zhì)體[19]。質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)橋構(gòu)成了共質(zhì)體通道，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞間物質(zhì)運輸有密切關(guān)聯(lián)，對植物的解除休眠有一定影響。簡令成等對楊樹芽進(jìn)行短日照處理誘導(dǎo)其進(jìn)入休眠期，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生收縮，打破了膜系統(tǒng)之間的聯(lián)系；長日照處理的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)收縮消失[20]。本試驗通過GA3和ABA處理黑穗醋栗，與長短日照起類似作用，GA3處理后芽細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)更早，長度更長。由此推測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在黑穗醋栗二次萌發(fā)過程中起重要作用。

線粒體作為細(xì)胞發(fā)生氧化還原反應(yīng)和能量轉(zhuǎn)換的主要場所，線粒體敏感而容易發(fā)生變化[21]。高文遠(yuǎn)等在浙貝母休眠前后超微結(jié)構(gòu)比較中提出，細(xì)胞間物質(zhì)與信息交換增加是細(xì)胞活躍的指標(biāo)之一，線粒體大量出現(xiàn)在細(xì)胞壁周圍與胞間聯(lián)系增加有關(guān)[22]。通過對GA3處理的黑豐與亞德進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中線粒體均出現(xiàn)在細(xì)胞壁胞間連絲周圍，這說明二次萌發(fā)過程中線粒體非?；钴S，為細(xì)胞間的聯(lián)系提供能量保障。GA3處理后線粒體分化數(shù)量明顯多于清水處理，并且結(jié)構(gòu)更加完整，體積更大，可以為細(xì)胞代謝提供充足能量；ABA處理則可明顯觀察到線粒體體積與數(shù)量減小。清水處理條件下，亞德細(xì)胞中線粒體數(shù)量明顯多于黑豐。本試驗觀察到在二次萌發(fā)后期黑豐細(xì)胞中線粒體成紡錘狀，說明此時線粒體處于積極增殖時期[23]；而亞德細(xì)胞中線粒體此時已經(jīng)結(jié)構(gòu)非常完整，內(nèi)部嵴狀結(jié)構(gòu)清晰，已經(jīng)可以充分供能。

從超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，黑穗醋栗芽細(xì)胞主要以淀粉粒的方式儲藏能量。隨著二次萌發(fā)進(jìn)程的加深，淀粉粒體積不斷變小，數(shù)量減少，說明淀粉粒通過自身水解為細(xì)胞代謝提供能量。孫紅梅等發(fā)現(xiàn)，蘭州百合在解除休眠過程中淀粉含量逐漸減少，這與本試驗觀察淀粉粒體積和數(shù)量變化相吻合[24]。本試驗發(fā)現(xiàn)，不同激素處理會對淀粉粒分解產(chǎn)生一定影響，GA3處理后細(xì)胞中淀粉粒完全分解，而ABA處理的細(xì)胞中仍可以觀察到淀粉粒存在。清水處理下，易二次萌發(fā)的亞德細(xì)胞中淀粉粒完全分解，而不易二次萌發(fā)的黑豐細(xì)胞中仍有淀粉粒剩余。這說明淀粉粒水解產(chǎn)生的能量對黑穗醋栗二次萌發(fā)起著重要作用。

液泡作為一個水相體系，積極地參與細(xì)胞代謝活動，對外界環(huán)境具有緩沖作用，維持胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。本試驗發(fā)現(xiàn)8月12日黑豐液泡中存在電子致密物質(zhì)，侯燕平等通過觀察冬季珍珠梅頂芽細(xì)胞結(jié)構(gòu)得出結(jié)論，液泡中電子致密物質(zhì)的積累是植物抗寒的一種預(yù)防機(jī)理[25]。清水處理下，黑豐與亞德細(xì)胞在二次萌發(fā)過程中液泡電子致密物質(zhì)均發(fā)生降解，說明細(xì)胞處于解除休眠的過程中。ABA處理9 d后，黑豐液泡中仍可以觀察到有電子致密物質(zhì)存在，而亞德細(xì)胞液泡中電子致密物質(zhì)完全降解。液泡中電子致密物質(zhì)未分解，則液泡濃度提高。方強恩在苜蓿根頸芽中同樣發(fā)現(xiàn)了液泡大量內(nèi)吞的現(xiàn)象，認(rèn)為提高液泡濃度、降低冰點，有利于提升抗寒性[26]。因此，不易二次萌發(fā)的黑豐對于不良環(huán)境的抗逆性要強于亞德。

4 結(jié)論

黑穗醋栗二次萌發(fā)實際上是解除休眠的過程，休眠進(jìn)程與細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有著密切聯(lián)系。本試驗通過對2種黑穗醋栗進(jìn)行激素處理，通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，GA3可加快細(xì)胞代謝，促進(jìn)細(xì)胞加速休眠期解除進(jìn)程。GA3與ABA、清水處理最大區(qū)別在于是否誘導(dǎo)了胞間連絲的分化。胞間連絲在胞間信息與物質(zhì)傳遞過程中有著不可或缺的重要作用，這可能是決定黑穗醋栗是否可以二次萌發(fā)的關(guān)鍵原因。通過觀察其他細(xì)胞器，GA3處理下線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、淀粉粒均較ABA和清水處理更加活躍，這為二次萌發(fā)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。質(zhì)壁分離為檢驗細(xì)胞是否在休眠期中的一個指標(biāo)，GA3處理大大加快了細(xì)胞打破休眠，而ABA則起抑制作用。液泡作為最敏感的細(xì)胞器，ABA處理使液泡中電子致密物質(zhì)不分解，大大提高了植物預(yù)防不利環(huán)境因素的能力。

本試驗初步推測了黑穗醋栗二次萌發(fā)各個細(xì)胞器的代謝規(guī)律，但未與黑穗醋栗春季萌發(fā)相對比。在下一階段試驗中會加強這部分的研究，以期從細(xì)胞學(xué)的角度解釋黑穗醋栗二次萌發(fā)的發(fā)生機(jī)理。