李 權(quán)， 李本鵬， 齊文玉， 任 凱， 林金國(guó)

(1.凱里學(xué)院，貴州凱里 556011； 2.福建農(nóng)林大學(xué)材料工程學(xué)院，福建福州 350002)

木材的腐朽不僅會(huì)造成大量的經(jīng)濟(jì)損失，還可導(dǎo)致嚴(yán)重的資源浪費(fèi)，因此亟須對(duì)木材進(jìn)行防腐處理[1]。為此，很多國(guó)家每年都投入大量的人力、物力研發(fā)新型木材防腐劑，以延長(zhǎng)木材的使用壽命?，F(xiàn)今對(duì)植物提取物進(jìn)行的研究通常集中在抑菌防腐、抗氧化及其應(yīng)用等方面[2-5]。Voda等將含有酚類、酚醚類和芳香醛的植物精油用于對(duì)木材腐朽菌的抑菌測(cè)試，探討了精油中化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗真菌活性之間的關(guān)系，這是當(dāng)前研究植物源提取物抑菌最常用的方法[6]；Lin等用5%肉桂葉的苯-乙醇提取物浸漬易腐朽的試材，明確了該植物提取物可以用于對(duì)易腐木材的防腐保護(hù)[7]；Tripathi等調(diào)查了馬纓丹根和莖的乙醇提取物對(duì)木材腐朽菌的抑制效果[8]；我國(guó)臺(tái)灣的Wang等從當(dāng)?shù)赝寥夤鹑~片中提取精油用于木材防腐，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取物中的主要成分是肉桂醛，相比其他成分具有更強(qiáng)的抑菌防腐功效[9]；李堅(jiān)等也都對(duì)當(dāng)?shù)氐牟糠帜透瘶?shù)種進(jìn)行了提取，研究了植物提取物的抑菌防腐效果[10]。經(jīng)過(guò)檢測(cè)明確了幾種耐腐樹(shù)種的心材提取物對(duì)部分木霉菌、木材腐朽菌等真菌具有較強(qiáng)的抑制活性。

綜上所述，研究者已經(jīng)探索了眾多類型的植物源提取物的抑菌防腐功效，也報(bào)道了大量植物提取物對(duì)木材腐朽菌良好的抑菌防腐效果。然而目前為止，對(duì)于植物源提取物的研究多集中在現(xiàn)象報(bào)道階段，真正的機(jī)制研究還很少，導(dǎo)致在發(fā)展和利用植物源提取物防腐方面存在著理論依據(jù)的缺失。本試驗(yàn)通過(guò)雙向電泳技術(shù)與質(zhì)譜分析技術(shù)相結(jié)合，分析受到樟腦抑制的木材腐朽菌與對(duì)照的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，從分子水平解析彩絨革蓋菌相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，最終為探索樟腦對(duì)木材腐朽菌的抑制機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 白腐菌為彩絨革蓋菌(Coriolusversicolor)，由福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.2 儀器與藥品 (1)儀器：固相pH值梯度等電聚焦儀EttanTM-IPGphorTMⅢ IEF System；垂直板電泳儀EttanTMDaltⅡ Vertical System，附件包括MutiTemp ⅢTM恒溫水浴以及EPS 3501 XL電源；5800型MALDI-TOF/TOF；ImageScanner Ⅲ光密度掃描儀；超速冷凍離心機(jī)；THY-111B型恒溫培養(yǎng)振蕩器。(2)藥品：固相pH值梯度干膠條(immobiline pH gradient，pH值3～10，長(zhǎng)度=24 cm)；IPG緩沖液、IPG覆蓋液、TCA、β-巰基乙醇、兩性電解質(zhì)pharmalyte(pH值3～10)、丙烯酰胺、SDS、過(guò)硫酸銨、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、硫脲、DTT、CHAPS、碘乙酰胺。樟腦購(gòu)置于福建青松股份有限公司，用化學(xué)合成法制得，含量>96.0%。將樟腦用三氯甲烷溶劑制備成濃度為10 mg/mL的溶液。丙酮為分析純，上海中試化工總公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 接種與培養(yǎng) 試驗(yàn)地點(diǎn)為福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。在250 mL三角燒瓶中加入100 mL麥芽糖培養(yǎng)基(參照GB/T 13942.1—2009《木材耐久性能 第1部分：天然耐腐性實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)方法》麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基的配制不加瓊脂)，用5 mm打孔器在培養(yǎng)好的白腐菌培養(yǎng)皿上取出3個(gè)菌柄放入麥芽糖培養(yǎng)基中，將濃度為10 mg/mL的樟腦溶液 1 mL 加入到三角燒瓶中，與對(duì)照一起放入28 ℃、40 r/min振蕩箱中培養(yǎng)14 d后取出并真空抽濾得到菌絲。

1.2.2 TCA丙酮法提取菌絲蛋白質(zhì) 將抽干后的菌絲液氮研磨，加入20 mL的TCA/丙酮振蕩均勻后放入-20 ℃中沉淀過(guò)夜。將沉淀過(guò)夜后的樣品4 ℃、11 000 r/min離心 15 min，去上清，再加入20 mL-20 ℃預(yù)冷的冷丙酮(內(nèi)含0.07%β-巰基乙醇)振蕩，靜置2 h，然后11 000 r/min離心15 min，去上清(重復(fù)2次，洗至沉淀白色)，再放到真空干燥箱中真空抽干。按適當(dāng)20 μL/mg標(biāo)準(zhǔn)加入裂解緩沖液，保持25～30 ℃超聲溶解2 h，最后11 000 r/min離心15 min后取上清即為蛋白樣品，對(duì)蛋白樣品濃度定量(濃度范圍為5～10 μg/μL)后放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蛋白質(zhì)雙向電泳

1.2.3.1 等電聚焦(IPG-IEF) 主動(dòng)上樣，水化和等電聚焦在EttanTM-IPGphorTMⅢ IEF System上自動(dòng)進(jìn)行，程序設(shè)置如表1所示。聚焦完畢后，分別用膠條平衡緩沖液Ⅰ(加DTT 10 mg/mL)和平衡緩沖液Ⅱ(加碘乙酰胺 25 mg/mL)，各緩慢平衡15 min。取出膠條后用濾紙小心吸去殘余平衡液，用電極緩沖液潤(rùn)洗后轉(zhuǎn)入濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠板中，加入相對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)，進(jìn)行二向垂直電泳。

表1 IEF參數(shù)設(shè)置

1.2.3.2 二向電泳與染色 將平衡好的IPG膠條貼于凝膠玻璃板上，加入1 mL瓊脂糖封膠液封住膠條，將凝膠板插入EttanTMDALT Ⅱ Vertical System的緩沖液柜中。在16 ℃水循環(huán)條件下進(jìn)行電泳，恒功率4 W/條，待示蹤溴酚藍(lán)至凝膠底部邊緣時(shí)停止電泳，取出凝膠后待固定液固定后進(jìn)行考染。

1.3 凝膠圖像分析

凝膠顯色后用Image Scanner掃描儀進(jìn)行圖像掃描，運(yùn)用Image MasterTM2D Platinum 7.0凝膠圖像分析軟件進(jìn)行 2-DE 圖譜分析。

1.4 膠內(nèi)酶解

建立差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜后，將新鮮的考馬斯亮藍(lán)染色的蛋白質(zhì)點(diǎn)從SDS-PAGE凝膠上割下切碎，置于96孔微孔板中。切碎的膠條首先用200 μL新鮮的含50 mmol/L NH4HCO3的50%乙腈溶液脫色2次，然后用200 μL乙腈干燥2次。干燥脫水的膠條加入消化液(含有12.5 ng/μL胰蛋白酶的20 mmol/L NH4HCO3溶液)孵育20 min，然后轉(zhuǎn)移到37 ℃孵育消化過(guò)夜。最后，用200 μL提取液(含5%甲酸的50%乙腈溶液)提取2次，收集上清液中的多肽合并。提取液在N2保護(hù)下干燥。

1.5 MALDI-TOF/TOF分析及數(shù)據(jù)的查詢

MALDI板用5800 MALDI-TOF/TOF分析儀(AB SCIEX)分析。每個(gè)點(diǎn)在m/z為700～3 600質(zhì)譜范圍內(nèi)采用正離子反射模式獲取一級(jí)質(zhì)譜，激光累積1 000次激發(fā)。MS數(shù)據(jù)用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn)，母離子的選擇按照如下標(biāo)準(zhǔn)：每點(diǎn)最多選擇50個(gè)母離子，信噪比最低設(shè)置為25，組分與組分間的質(zhì)量偏差設(shè)置為0.2 u。串聯(lián)質(zhì)譜采用2 500次激光累積和100分辨率的質(zhì)量窗口(半峰高寬度，F(xiàn)WHM)，碰撞能量設(shè)置為 2 kV，MS/MS數(shù)據(jù)采用默認(rèn)校準(zhǔn)，得到的數(shù)據(jù)通過(guò)軟件GPS(V3.6)采用MASCOT(V 2.3)進(jìn)行檢索。搜索參數(shù)如下：真菌蛋白質(zhì)(1 757 520條序列；762 750 636個(gè)殘基)、胰酶酶切，1個(gè)漏切位點(diǎn)，一級(jí)質(zhì)譜的容差為0.1 u，二級(jí)質(zhì)譜的容差為0.6 u。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后，蛋白質(zhì)得分>75分被認(rèn)為鑒定成功(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體總蛋白雙向電泳圖譜的繪制

設(shè)計(jì)3次生物學(xué)重復(fù)，從圖1可以看出，所得電泳圖譜背景清晰，蛋白質(zhì)點(diǎn)分辨率高，蛋白質(zhì)點(diǎn)大規(guī)模聚集現(xiàn)象和橫縱向拖尾少。經(jīng)軟件對(duì)比發(fā)現(xiàn)，同一彩絨革蓋菌的3次生物學(xué)重復(fù)之間的蛋白質(zhì)點(diǎn)重復(fù)出現(xiàn)率超過(guò)92%，試驗(yàn)結(jié)果可靠性極高。樟腦處理后彩絨革蓋菌以及對(duì)照之間蛋白點(diǎn)的分布大體相似，個(gè)別點(diǎn)則有較明顯的差異，說(shuō)明這2種樣品所表達(dá)的蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量有所差別。

2.2 凝膠掃描結(jié)果分析

采用Image MasterTM2D Platinum 7.0差異分析軟件對(duì)樟腦處理白腐菌與對(duì)照的雙向聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳圖譜進(jìn)行比對(duì)分析，由圖2可知，2種蛋白雙向電泳圖譜格局基本一致，蛋白質(zhì)點(diǎn)主要集中在等電點(diǎn)(pI)4～7的范圍內(nèi)。樟腦處理白腐菌電泳圖和對(duì)照樣電泳圖中分別可分辨別出444、433個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，對(duì)各樣品蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜進(jìn)行比較，蛋白質(zhì)豐度變化在2倍以上，并且3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)的置信率大于95%(平均比值>2.0，方差<0.05)為條件進(jìn)行篩選，共發(fā)現(xiàn)28個(gè)差異明顯的蛋白點(diǎn)，鑒定出15個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。其中編號(hào)為254、256、651、211、205、620、635的7個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)下調(diào)，編號(hào)為634、618、624、540、613、201、537、605的8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)上調(diào)(圖3、表2)。

2.2.1 6-磷酸葡糖胺脫氨酶(glucosamine-6-phosphate deaminase，GNPDA) 6-磷酸葡糖胺脫氨酶是一種催化酶[11]，在糖胺代謝中起重要作用，可以催化6-磷酸葡糖胺通過(guò)脫氨和異構(gòu)2步反應(yīng)生成6-磷酸果糖；6-磷酸葡糖胺脫氨酶對(duì)于N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)是否被利用最終進(jìn)入糖酵解途徑起關(guān)鍵作用[12]。葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶(EC 3.5.99.6)是GlcNAc分解代謝途徑的終末酶[13]。

2.2.2 核糖體蛋白質(zhì)S5(ribosomal protein S5) 核糖體蛋白質(zhì)S5是核糖體蛋白質(zhì)家族的重要成員，在核糖體中發(fā)揮重要作用[14]，其生物學(xué)過(guò)程與細(xì)胞質(zhì)翻譯、核糖體小亞基組裝等有關(guān)。核糖體蛋白質(zhì)S5是構(gòu)成核糖體的重要成分，具有連接病毒和核糖體、調(diào)控細(xì)胞分化凋亡等核糖體外的功能，在蛋白質(zhì)翻譯準(zhǔn)確性，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成以及tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮著必不可少的作用[15]，與mRNA結(jié)合、rRNA結(jié)合、核糖體的結(jié)構(gòu)成分等分子功能有關(guān)。

2.2.3 絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶(Ser/Thr protein phosphatase) 絲/氨酸硫醇蛋白質(zhì)酶往往在其酶的活性中心含有絲氨酸的羥基或半胱氨酸的巰基，如胰蛋白質(zhì)酶、木瓜蛋白質(zhì)酶、糜蛋白質(zhì)酶、凝血酶、組織蛋白質(zhì)酶、彈性蛋白質(zhì)酶等，凡能與這些酶的活性中心結(jié)合、有效地降低其酶活性、又不使蛋白質(zhì)酶變性的物質(zhì)稱為絲氨酸硫醇蛋白質(zhì)酶抑制劑或絲氨酸巰基蛋白質(zhì)酶抑制劑。絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶屬于蛋白質(zhì)磷酸酶家族中重要的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，能夠催化磷酸化絲氨酸或使蛋白質(zhì)脫磷酸，并參與許多關(guān)鍵的生物學(xué)過(guò)程，在新陳代謝，DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯，細(xì)胞周期進(jìn)程，信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞凋亡和胞外分泌等過(guò)程中均起重要作用[16]。

表2 樟腦處理彩絨革蓋菌差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

2.2.4 假定ssDNA結(jié)合蛋白質(zhì)(putative ssDNA binding protein) 假定ssDNA結(jié)合蛋白(SSB)在細(xì)菌、古細(xì)菌和真核細(xì)胞的DNA復(fù)制、重組和修復(fù)中起著重要作用。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)得到樟腦處理彩絨革蓋菌與對(duì)照的差異蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，經(jīng)分析得出以下結(jié)論：以2個(gè)樣品之間平均表達(dá)差異倍數(shù)大于2倍、且重復(fù)性好、差異表達(dá)變化明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)15個(gè)，其中8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)上調(diào)表達(dá)，7個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)下調(diào)表達(dá)；絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶等蛋白質(zhì)的下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明白腐菌在新陳代謝，DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯，細(xì)胞周期進(jìn)程，信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞凋亡和胞外分泌等方面也受到了抑制。本試驗(yàn)結(jié)果可為新型木材防腐劑的研制以及闡明樟腦抑制白腐菌的分子機(jī)制提供參考。