周 洲，高采平，邱春華，王 晗，李良平

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，成都 610072)

胃癌是實(shí)體腫瘤中最為常見(jiàn)的一種[1]。影響胃癌治療效果和死亡的主要原因是轉(zhuǎn)移。臨床上，很多胃癌患者在行根治性手術(shù)前已出現(xiàn)微轉(zhuǎn)移，為術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的直接原因。探討與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的因素，闡明其轉(zhuǎn)移機(jī)制，控制轉(zhuǎn)移，尋找預(yù)防和治療的有效途徑，是當(dāng)前研究的重要方向。CD44是由20個(gè)外顯子編碼，通過(guò)選擇性剪接而產(chǎn)生CD44標(biāo)準(zhǔn)體(CD44s)和CD44變異體(CD44v)[2]。CD44s由CD44外顯子1～5及16～20組成。而CD44變異體分為CD44v1～v10，分別由對(duì)應(yīng)的外顯子6～15編碼而成，這些外顯子可以通過(guò)選擇性剪接單個(gè)的或多個(gè)的和CD44的標(biāo)準(zhǔn)體組合進(jìn)而可能產(chǎn)生數(shù)千種不同的CD44亞型，每種CD44亞型可能作用不同，因此，CD44結(jié)構(gòu)和功能都很復(fù)雜[3]。CD44標(biāo)準(zhǔn)體和亞型都與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，特別是CD44v3、CD44v6、CD44v9。為了解在胃癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中，CD44s及各亞型的表達(dá)水平、表達(dá)變化，用兩種胃癌細(xì)胞構(gòu)建原位胃癌模型，在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，采用循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)CD44各亞型表達(dá)水平及變化過(guò)程，并采用免疫組織化學(xué)及Western blot了解原位胃癌中CD44各亞型表達(dá)水平，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 SGC-7901、MNK-45胃癌細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。4～6周齡BALB/c-nude雌性裸鼠，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。免疫組織化學(xué)SP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。CD44s引物、CD44v3引物，CD44v6引物，CD44v9引物由上海生工公司合成。CTC細(xì)胞提取磁珠CELLectionTMEpithelial Enrich購(gòu)自Life Technologies公司，單細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Single cell-to-Ct購(gòu)自Ambion公司，qPCR試劑盒SsoAdvanced SYBR綠色熒光超級(jí)混合液購(gòu)自Biorad公司。CD44v3、CD44v6、CD44v9單克隆抗體及二抗均購(gòu)自Abcam公司。

1．2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901、MNK-45胃癌細(xì)胞均在含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2裸鼠原位瘤模型的構(gòu)建 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/mL。用注射器在每只裸鼠右側(cè)肩胛部皮下注射細(xì)胞懸液0.1 mL，注射后輕壓5 s。每組2只裸鼠。將裸鼠重新放回籠中觀察，右側(cè)肩胛部皮下出現(xiàn)米粒大小質(zhì)硬結(jié)節(jié)為模型建立成功。2周后，以頸椎脫臼法處死，小心剝?nèi)∫浦擦?，在培養(yǎng)液中分割成1 mm×1 mm的組織碎塊。接下來(lái)建立原位胃癌移植模型，每組10只。用濃度為2.5%異氟烷誘導(dǎo)麻醉，待裸鼠鎮(zhèn)痛后，用手術(shù)剪在裸鼠左上腹部做一約1 cm的橫切口，暴露腹腔組織，小心分離將胃暴露出腹腔，用生物膠將1塊胃癌組織粘在裸鼠胃組織上。然后用6.0不可吸收外科縫線關(guān)閉腹腔。整個(gè)操作過(guò)程在超凈工作臺(tái)中完成。之后每天觀察裸鼠狀態(tài)，測(cè)量裸鼠體質(zhì)量。8周后，當(dāng)裸鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)(表現(xiàn)為消瘦，腹水及精神萎靡)，處死所有裸鼠，剖腹觀察并統(tǒng)計(jì)原發(fā)腫瘤大小，轉(zhuǎn)移灶位置及個(gè)數(shù)，同時(shí)對(duì)原發(fā)腫瘤進(jìn)行稱質(zhì)量。分離轉(zhuǎn)移瘤及原發(fā)灶，放入10%甲醛中固定，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。另取部分原發(fā)灶腫瘤組織保存于液氮罐中，用于RT-PCR及Western blot的檢測(cè)。

1.2.3收集裸鼠眼眶血采集CTC 于造模后第2、3、4周從裸鼠眼眶靜脈叢采血。左手拇指及食指輕輕壓迫動(dòng)物的頸部?jī)蓚?cè)，使眶后靜脈叢充血。右手持續(xù)接7號(hào)針頭的1 mL注射器由眼內(nèi)角刺入，針頭斜面先向眼球，刺入后再轉(zhuǎn)180°使斜面對(duì)著眼眶后界。當(dāng)感到有阻力時(shí)即停止推進(jìn)，同時(shí)，將針退出約0.1～0.5 mm，邊退邊抽。每次采血量每只約0.2～0.3 mL。通過(guò)免疫磁珠富集法(試劑盒：CELLectionTMEpithelial Enrich)收集裸鼠CTC富集液，將篩選的細(xì)胞液在顯微平臺(tái)下進(jìn)行形態(tài)學(xué)篩選，共篩選了3個(gè)循環(huán)腫瘤組織。篩選標(biāo)準(zhǔn)：(1) 細(xì)胞呈圓形、橢圓形或長(zhǎng)形，長(zhǎng)徑大于10 μm；(2)光鏡下可見(jiàn)完整細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核；(3)核漿比失常。將選定的CTC在單細(xì)胞挑取臺(tái)上細(xì)針挑取收集，以備單細(xì)胞RT-qPCR分析。

1.2.4RT-qPCR檢測(cè)CD44 mRNA水平表達(dá)的變化 收集后的CTC行單細(xì)胞RT-qPCR，檢測(cè)CTC CD44各亞型(CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9)表達(dá)差異。Single cell-to-Ct試劑盒提取3個(gè)細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以CD44各亞型及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)對(duì)應(yīng)引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增后產(chǎn)物2 μL加入25 μL含對(duì)應(yīng)引物的SsoAdvanced SYBR 綠色熒光超級(jí)混合液進(jìn)行qPCR，采用SYBR綠色熒光標(biāo)記法檢測(cè)PCR產(chǎn)物。檢測(cè)各基因表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參照。RT-qPCR結(jié)果采用儀器自帶軟件分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算基因拷貝數(shù)。記錄各實(shí)驗(yàn)組熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的mRNA的相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCt)。所有引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank的基因序列、用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1。

1.2.5免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD44各亞型蛋白的表達(dá) 分離得到的腫瘤組織包埋、固定、石蠟切片、脫蠟，3%H2O2室溫孵育30 min，熱修復(fù)抗原，滴加正常山羊封閉液封閉，加入一抗兔抗人CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9單克隆抗體，濕盒4 ℃中過(guò)夜，次日加入二抗鼠抗兔抗體，濕盒中37 ℃、30 min、DAB顯色，常規(guī)乙醇梯度脫水、透明、封片，顯微鏡觀察并記錄。陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。

1.2.6Western blot檢測(cè)CD44各亞型蛋白的表達(dá) 提取原位胃癌組織的總蛋白并定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，調(diào)節(jié)電壓，分離膠120 V，基層膠60 V，以染料的前沿遷移至凝膠的底部為標(biāo)準(zhǔn)終止電泳。恒定電流70 mA轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂奶粉封閉膜，一抗孵育4 ℃搖床過(guò)夜，加二抗37 ℃孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，顯影定影，沖洗膠片，對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

表1 RT-qPCR引物模板

2 結(jié) 果

2.1裸鼠一般生存情況分析 SGC-7901組細(xì)胞及MNK-45組細(xì)胞均成功構(gòu)建皮下移植瘤，小心剝?nèi)∫浦擦觯谂囵B(yǎng)液中分割成1 mm×1 mm的組織碎塊，分別建立原位胃癌移植模型，每組10只。兩組裸鼠均成功構(gòu)建原位胃癌模型，見(jiàn)圖1。SGC7901組在觀察第2周1只裸鼠發(fā)生死亡，在第4周有2只裸鼠發(fā)生死亡，其余裸鼠均順利采集CTC。MNK-45組在第2周有2只裸鼠發(fā)生死亡，第3、4周分別有1只裸鼠發(fā)生死亡，其余裸鼠均順利采集CTC。

A：裸鼠皮下移植瘤;B:剝?nèi)∫浦擦?C:構(gòu)建原位胃癌模型。

圖1裸鼠造模情況

2.2CTC計(jì)數(shù)變化 于造模后第1、2、3、4周從裸鼠眼眶靜脈叢采血。通過(guò)免疫磁珠富集法收集裸鼠CTC富集液，將篩選的細(xì)胞液在顯微平臺(tái)下進(jìn)行形態(tài)學(xué)篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)如前所述，計(jì)數(shù)CTC，兩組原位胃癌CTC細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)遞增，見(jiàn)圖2。

圖2 裸鼠CTC計(jì)數(shù)水平

2.3CD44各亞型表達(dá)水平差異 采用RT-qPCR檢測(cè)CTC細(xì)胞中CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9表達(dá)水平變化。在SGC-7901組，隨著時(shí)間進(jìn)展，各組基因表達(dá)量逐漸升高，不同時(shí)間組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=461.547，P=0.000)，CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9均如此，時(shí)間和各組基因表達(dá)量存在交互效應(yīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.386，P=0.000)。在MNK-45組，研究結(jié)果與SGC-7901組相似，隨著時(shí)間進(jìn)展，各組基因表達(dá)量逐漸升高，不同時(shí)間組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=537.642，P=0.000)，CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9均如此，時(shí)間和各組基因表達(dá)量存在交互效應(yīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.122，P=0.000)。SGC-7901組和MNK-45組CD44v9表達(dá)水平在各時(shí)間均明顯高于CD44s、CD44v3、CD44v6，見(jiàn)表2。

2.4免疫組織化學(xué)及Western blot了解CD44各亞型表達(dá)差異 將兩組裸鼠處死后，分離原位胃癌組織，采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9在原位胃癌中的表達(dá)水平。在兩組細(xì)胞構(gòu)建的原位胃癌中，CD44v9表達(dá)水平最高，細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)明顯棕黃色顆粒，呈強(qiáng)陽(yáng)性，且主要集中在細(xì)胞膜，明顯高于CD44s、CD44v3，CD44v6表達(dá)水平。Western blot結(jié)果，在SGC-7901組中，CD44v9蛋白表達(dá)水平明顯高于CD44s、CD44v3，CD44v6組(F=13.486，P<0.05)。在MNK-45組，CD44v9蛋白表達(dá)水平也明顯高于CD44s、CD44v3、CD44v6組(F=10.578，P<0.05)，見(jiàn)圖4。

表2 各CD44亞型隨時(shí)間表達(dá)差異

A：SGC-7901 CD44s表達(dá)水平(免疫組織化學(xué)×200)；B：SGC- 7901 CD44v3表達(dá)水平(免疫組織化學(xué)×200)；C：SGC- 7901 CD44v6表達(dá)水平(免疫組織化學(xué)×200)；D：SGC-7901 CD44v9表達(dá)水平(免疫組織化學(xué)×200)；E：MNK-45 CD44s表達(dá)水平(免疫組織化學(xué)×200)；F：MNK-45 CD44v3表達(dá)水平(免疫組織化學(xué)×200)；G：MNK-45 CD44v6表達(dá)水平(免疫組織化學(xué)×200)；H：MNK-45 CD44v9表達(dá)水平(免疫組織化學(xué)×200)；I、J：Western blot檢測(cè)胃癌中蛋白質(zhì)的表達(dá)量

圖4 CD44各亞型表達(dá)差異

3 討 論

在我國(guó)胃癌是一種發(fā)病率高、惡性程度高、預(yù)后不良的惡性腫瘤。長(zhǎng)期以來(lái),臨床手術(shù)切除及輔助性放療、化療技術(shù)的應(yīng)用并沒(méi)有帶來(lái)滿意的生存率[4]。

CD44是黏附分子家族成員，在胃癌轉(zhuǎn)移中有重要作用。SAKAKURA等[5]通過(guò)對(duì)一系列胃癌細(xì)胞系的研究，及多種與胃癌干細(xì)胞相關(guān)的表面分子標(biāo)記物的篩選，提出CD44具有作為胃癌干細(xì)胞表面分子標(biāo)記物的可能。CD44的結(jié)構(gòu)和功能非常復(fù)雜，目前研究多集中在CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9。在卵巢癌中，研究發(fā)現(xiàn)CD44v6的表達(dá)在復(fù)發(fā)性腫瘤比原發(fā)性要高，尤其在腹腔的轉(zhuǎn)移癌，CD44v6的表達(dá)和臨床病理參數(shù)及腫瘤進(jìn)展相關(guān)，干擾CD44v6則降低了腫瘤細(xì)胞的黏附及遷移能力[6]。在結(jié)直腸癌中，也有研究發(fā)現(xiàn)CD44v6的表達(dá)和間質(zhì)表型及較差的預(yù)后相關(guān)[7]。CD44v9在結(jié)腸癌的腫瘤干細(xì)胞發(fā)揮重要作用，影響結(jié)腸癌的腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移，并且CD44v9在一些腫瘤中被作為腫瘤干細(xì)胞的分子標(biāo)記物[8]。在胃癌中，HIRATA等[9]研究了88例胃癌標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，CD44v9在復(fù)發(fā)性的胃癌中高表達(dá)，認(rèn)為CD44v9是監(jiān)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)的有效指標(biāo)。MIMA等[10]在肝癌中研究發(fā)現(xiàn)CD44s能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β介導(dǎo)的間質(zhì)表型進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后，并認(rèn)為CD44s的高表達(dá)是肝癌潛在的治療靶點(diǎn)。但是，并非所有的研究都支持CD44的高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。在前列腺癌中，LAZARI等[11]在研究了135例前列腺癌患者標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，CD44s的低表達(dá)和前列腺癌的侵襲能力相關(guān)；在舌癌中，也有發(fā)現(xiàn)CD44s的低表達(dá)與舌癌腫瘤細(xì)胞的侵襲能力相關(guān)，并認(rèn)為它是臨床相關(guān)的預(yù)后指標(biāo)[12]。

盡管CD44在很多細(xì)胞的進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)等方面發(fā)揮重要作用，關(guān)于CD44變異體和標(biāo)準(zhǔn)體在腫瘤中發(fā)揮的作用卻眾說(shuō)紛紜，觀點(diǎn)不一，各個(gè)研究報(bào)道也不一致甚至互相矛盾。CD44v與CD44s可能發(fā)揮完全不同的作用，若將CD44作為一個(gè)整體研究時(shí)，可能造成遺漏轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要基因轉(zhuǎn)型，妨礙對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。因此，在研究CD44時(shí)，不能將CD44作為單一的整體分子而要具體細(xì)分進(jìn)行研究。實(shí)際上，到目前為止，尚少見(jiàn)系統(tǒng)性的在胃癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中研究CD44各亞型動(dòng)態(tài)變化的報(bào)道。

本研究采用兩種胃癌細(xì)胞系構(gòu)建原位胃癌模型，收集在原位胃癌生長(zhǎng)過(guò)程中CTC，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9在胃癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的表達(dá)變化。結(jié)果表明，CD44v9在兩種胃癌細(xì)胞的造模模型中均隨時(shí)間表現(xiàn)出明顯升高，明顯高于CD44s、CD44v3、CD44v6的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且進(jìn)一步原位胃癌免疫組織化學(xué)及Western blot也表明，CD44v9表達(dá)水平在原位胃癌中最高，和HIRAGA等[12]研究結(jié)果一致。表明在胃癌轉(zhuǎn)移模型中，CD44v9表達(dá)水平隨時(shí)間推移均高于其他CD44亞型，可能在腫瘤轉(zhuǎn)移中起主導(dǎo)作用。

CD44與胃癌轉(zhuǎn)移是目前研究的熱點(diǎn)，靶向CD44可能成為治療胃癌的新途徑。但既往研究將CD44作為一個(gè)整體，靜態(tài)地在腫瘤組織中研究CD44表型具有很大局限性。本研究表明CD44v9在胃癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起主導(dǎo)作用，為胃癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制及靶向治療奠定基礎(chǔ)。