裴 樂(lè) ，李 鋒 ，劉秀麗 ，喬健敏 ，范金林 ，侯勇躍

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.呼和浩特市賽罕區(qū)農(nóng)牧業(yè)局，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

小白蒿，又名冷蒿，蒙藥名稱譯為“阿給”，屬菊科蒿屬，其味苦、鈍、澀、燥[1]，性涼，為多年生植物，多見(jiàn)于草原荒漠地帶，在牧區(qū)既被當(dāng)作母畜的營(yíng)養(yǎng)飼料，又被用作預(yù)防各種疾病的蒙藥湯劑，有止血、消腫、消“奇哈”的功效[2]。 據(jù)《晶珠本草》[3]記載，其有止血、祛風(fēng)、消腫的功效，主治各種出血、關(guān)節(jié)腫脹、腎熱、月經(jīng)不調(diào)、瘡癰，有些地區(qū)將其作為茵陳的替代品使用。

小白蒿中的有效成分主要包括黃酮類物質(zhì)、倍半萜類物質(zhì)、苯丙素類物質(zhì)以及對(duì)甲基苯酚、4-羥基苯乙酮、β-谷甾醇、胡蘿卜苷和苯甲酸等其他物質(zhì)，其中，黃酮類物質(zhì)主要為麥黃酮、木犀草素、棕矢車菊素、藿香苷、澤蘭黃素、薊黃素、田薊苷、槲皮素、山柰酚、蘆丁等[4-11]。大量研究表明，小白蒿中的黃酮類物質(zhì)具有不同程度的清除自由基能力，且清除率優(yōu)于VC，其體外抗氧化活性較強(qiáng)[12]。同時(shí)，其在抗菌、抗炎及抗腫瘤等方面也有比較突出的表現(xiàn)。小白蒿在多個(gè)方面影響白細(xì)胞的功能，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，從而達(dá)到抗炎免疫、抗腫瘤的效果[13-14]。此外，小白蒿還具有止血和抗寄生蟲(chóng)等作用[15-16]。該研究以蒙藥小白蒿為主要研究對(duì)象，對(duì)其黃酮類藥效物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了研究，通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考查溶劑種類及其濃度、小白蒿與溶劑的料液比、提取溫度和提取時(shí)間等影響小白蒿總黃酮提取效果的因素，以期為今后更好地開(kāi)發(fā)利用小白蒿提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蒙藥與試劑

小白蒿：將蒙藥小白蒿粉碎后，過(guò)篩，將大量的棉絮狀物質(zhì)棄去，留下粉末，置于廣口瓶中避光保存。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，貴州迪大生物科技有限公司，批號(hào)：GZDD-0001）；無(wú)水乙醇（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；Al（NO3）3·9H2O（分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司）；NaNO2（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；NaOH（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。使用蒸餾水將Al （NO3）3·9H2O、Na NO2、NaOH 分別配制成 10%Al（NO3）3溶液、5%NaNO2溶液、4%NaOH 溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

FA200413電子天平（上海佑科舜儀器儀表有限公司）；UV1000單光束紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；Super Mini Dancer調(diào)速型迷你離心機(jī)[（生工生物工程（上海）股份有限公司]；金怡HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；Lab ServTMLS-O610強(qiáng)制對(duì)流型烘箱（賽默飛世爾科技）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于40℃恒溫箱中，烘干至重量不變，準(zhǔn)確稱取24 mg，用20 mL 60%乙醇溶液溶解，配制成1.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋，配制濃度 依 次 為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mg/mL。每個(gè)試管中分別吸取蘆丁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，空白對(duì)照組為60%的乙醇溶液，也同樣吸取1.0 mL加入試管中備用。向空白對(duì)照液和蘆丁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，靜置6 min，當(dāng)溶液顏色變?yōu)闇\黃色時(shí)，再分別加入 10%Al（NO3）3溶液 0.3 mL，靜置 6 min后，當(dāng)溶液顏色逐漸變深且呈姜黃色時(shí)，分別加入4%NaOH溶液4.0 mL，此時(shí)顏色應(yīng)變?yōu)槭窦t色，靜置15 min后，每個(gè)試管中分別加入60%的冰乙醇溶液4.4 mL定容，即每只試管溶液的總體積為10 mL，最后于相應(yīng)波長(zhǎng)進(jìn)行吸光度值（OD值）的測(cè)定，重復(fù)3次取平均值。

1.3.2 最大檢測(cè)波長(zhǎng)的確定：使用濃度為0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行上述試驗(yàn)，在450～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描測(cè)定OD值，重復(fù)3次，選擇相對(duì)穩(wěn)定的最大OD測(cè)定值，確定最大檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3.3 小白蒿總黃酮的提?。悍Q取干燥的小白蒿粉末置于燒瓶中提取回流，分別考查提取所用的溶劑種類及其濃度、小白蒿與溶劑的料液比、提取溫度和提取時(shí)間等影響小白蒿總黃酮提取效果的因素。試驗(yàn)重復(fù)3次，將混合液合并后真空抽濾即得到小白蒿的總黃酮提取混合液。

1.3.3.1 提取溶劑及其濃度的選擇：根據(jù)前期抑菌預(yù)試驗(yàn)及相關(guān)參考文獻(xiàn)[12，17-18]，選擇石油醚、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、蒸餾水、超純水等溶劑對(duì)100 mg的小白蒿粉末進(jìn)行回流提取，吸取待測(cè)溶液0.1 mL，加入相應(yīng)溶劑0.9 mL，對(duì)待測(cè)提取液進(jìn)行稀釋，即待測(cè)液稀釋10倍后分別加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，靜置6 min后，再分別加入10%的 Al（NO3）3溶液 0.3 mL，靜置 6 min 后，再分別加入4%的NaOH溶液4.0 mL，靜置15 min后，每個(gè)試管中分別加入60%的冰乙醇溶液4.4 mL定容至10 mL，最后于相應(yīng)波長(zhǎng)進(jìn)行OD值的測(cè)定，重復(fù)3次取平均值。同時(shí)進(jìn)一步使用50%、60%、70%、80%、90%、100%的溶劑浸泡小白蒿后，進(jìn)行上述試驗(yàn)，測(cè)定其OD值，代入線性回歸方程，分別得到不同濃度溶劑下的小白蒿總黃酮濃度，比較小白蒿總黃酮濃度，進(jìn)而選擇溶劑并確定其濃度。

1.3.3.2 小白蒿與溶劑料液比的選擇：分別取1 000 mg 的小白蒿粉末， 置于 5、10、15、20、25、30 mL的溶劑中，即小白蒿與溶劑料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，浸泡后進(jìn)行 1.3.3.1試驗(yàn)，測(cè)定其OD值，確定小白蒿總黃酮的濃度。根據(jù)參考文獻(xiàn)[19]，各溶劑的總體積不同，小白蒿總黃酮提取率=（小白蒿總黃酮的測(cè)定濃度/小白蒿溶液的總濃度）×100%，根據(jù)小白蒿總黃酮提取率的大小，確定小白蒿與溶劑的料液比。

1.3.3.3 提取溫度：分別取100mg的小白蒿粉末置于一定量的溶劑中， 選擇 30、40、50、60、70、80 ℃進(jìn)行回流提取，隨后進(jìn)行1.3.3.1試驗(yàn)，測(cè)定其OD值，確定小白蒿總黃酮的濃度，進(jìn)而選擇提取溫度。

1.3.3.4 提取時(shí)間：分別取100 mg的小白蒿粉末置于一定量的溶劑中，選擇 0.5、1、2、3、4、5 h 進(jìn)行回流提取，隨后進(jìn)行1.3.3.1試驗(yàn)，測(cè)定其OD值，確定小白蒿總黃酮的濃度，進(jìn)而選擇提取時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的終濃度（mg/mL）為X值，相對(duì)應(yīng)的OD510nm值的平均值為Y值 （重復(fù)3次），得到線性回歸方程y=9.6084x-0.0139，R2=0.9971。建立的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，以蘆丁的濃度來(lái)反映總黃酮的含量。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 最大檢測(cè)波長(zhǎng)

由圖2可知，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)小于490 nm時(shí)，OD值逐漸升高；當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)大于等于490 nm且小于等于520 nm時(shí)，OD值逐漸增加至峰值，并趨于穩(wěn)定；當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)大于520 nm時(shí)，OD值逐漸降低。根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)[12，17]及多次試驗(yàn)結(jié)果，確定最大吸收光譜，選定相對(duì)穩(wěn)定的最大OD測(cè)定值，重復(fù)3次得到平均值，最后確定檢測(cè)波長(zhǎng)為510 nm。

2.3 小白蒿總黃酮的提取

圖2 全波長(zhǎng)掃描結(jié)果

2.3.1 提取溶劑種類及其濃度的選擇：根據(jù)前期抑菌預(yù)試驗(yàn)及相關(guān)參考文獻(xiàn)[12，17-18]，發(fā)現(xiàn)使用乙醇（50%～100%）的效果最好，且紙片法測(cè)定抑菌圈大小的結(jié)果也表明選擇乙醇（50%～100%）作為溶劑的抑菌強(qiáng)度最強(qiáng)，之后對(duì)不同濃度的乙醇（50%～100%）進(jìn)行了測(cè)定試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著乙醇濃度逐漸升高，其OD測(cè)定值逐漸升高，即小白蒿總黃酮的濃度逐漸升高，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，OD值達(dá)到峰值，之后隨著乙醇濃度的升高，OD值基本趨于平衡，略有下降，當(dāng)乙醇濃度高于70%之后，OD值在急速下降后趨于平衡。急速下降的原因可能是隨著乙醇濃度的升高，小白蒿中的水溶性黃酮類物質(zhì)析出逐漸減少，脂溶性的其他物質(zhì)析出逐漸增多，兩者競(jìng)爭(zhēng)性地爭(zhēng)奪溶劑，從而導(dǎo)致溶劑中的黃酮類物質(zhì)逐漸減少[19]。因此，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)小白蒿總黃酮的濃度最大，故選擇小白蒿總黃酮的提取溶劑為60%的乙醇。

圖3 乙醇濃度的選擇

2.3.2 小白蒿與溶劑料液比的選擇結(jié)果：小白蒿與 60%乙醇的料液比分別為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30， 浸泡后進(jìn)行 1.3.3.1 試驗(yàn)， 測(cè)定其 OD值，但因測(cè)定溶液的總體積不同，故影響其濃度，根據(jù)參考文獻(xiàn)[19]，計(jì)算小白蒿的總黃酮提取率，以其提取率的大小來(lái)選擇小白蒿與60%乙醇的料液比。由圖4可知，圖中X軸1～6序號(hào)分別表示料液比為 1∶5（序號(hào) 1）、1∶10（序號(hào) 2）、1∶15（序號(hào) 3）、1∶20（序號(hào) 4）、1∶25（序號(hào) 5）、1∶30（序號(hào) 6），Y 軸表示相應(yīng)料液比下的小白蒿總黃酮提取率（%）。當(dāng)60%乙醇體積逐漸增大時(shí)，小白蒿的總黃酮提取率也在逐漸升高；當(dāng)小白蒿與60%乙醇的料液比達(dá)到1∶25（序號(hào)5）時(shí)，小白蒿的總黃酮在60%乙醇中充分溶解，已經(jīng)達(dá)到飽和，故小白蒿的總黃酮提取率升高到最大值，并在之后稍微降低，因此，選擇小白蒿與60%乙醇的料液比為1∶25（序號(hào)5）。

圖4 小白蒿與60%乙醇料液比的選擇

2.3.3 提取溫度的選擇結(jié)果：分別取100 mg的小白蒿粉末置于一定量的60%乙醇溶液中，小白蒿與 60%乙醇的料液比為 1∶25，選擇 30、40、50、60、70、80℃進(jìn)行回流提取后，隨后進(jìn)行1.3.3.1試驗(yàn)，測(cè)定其OD值。由圖5可知，當(dāng)提取溫度在30～50℃時(shí)，其OD值基本平衡，變化不明顯；之后，隨著溫度逐漸升高，分子的運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，其OD值也逐漸升高，即小白蒿總黃酮的溶出量逐漸增大，當(dāng)溫度達(dá)70℃時(shí)，OD值達(dá)到峰值；當(dāng)溫度升高到70℃之后，物質(zhì)結(jié)構(gòu)遭受到高溫的破壞，除了總黃酮以外的其他雜質(zhì)的溶出量也相應(yīng)增加，OD值下降，小白蒿總黃酮濃度降低，因此，選擇小白蒿總黃酮的最佳提取溫度為70℃。

圖5 提取溫度的選擇

2.3.4 提取時(shí)間的選擇結(jié)果：分別取100 mg的小白蒿粉末置于一定量的60%乙醇中，小白蒿與60%乙醇的料液比為 1∶25，選擇 0.5、1、2、3、4、5 h進(jìn)行回流提取，隨后進(jìn)行1.3.3.1試驗(yàn)，測(cè)定其OD值。由圖6可知，當(dāng)提取時(shí)間在0.5～2 h時(shí)，其OD值逐漸升高，且增加的速度較快；2 h之后，其OD值增加的速度放緩，接近飽和狀態(tài)，之后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，其OD值升高，考慮可能是因?yàn)楦邷匚龀銎渌幕钚晕镔|(zhì)或是其他干擾物質(zhì)，以及自身有效成分的破壞損失，故選擇4 h為最佳提取時(shí)間。

圖6 提取時(shí)間的選擇

3 小結(jié)

該研究以傳統(tǒng)中蒙獸藥小白蒿為主要研究對(duì)象，對(duì)傳統(tǒng)的紫外分光光度法測(cè)定其總黃酮濃度的方法進(jìn)行了優(yōu)化。利用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別考查了溶劑及其濃度、小白蒿與溶劑的料液比、提取溫度以及提取時(shí)間等一系列提取條件對(duì)小白蒿總黃酮提取效果的影響，確定了小白蒿總黃酮類物質(zhì)的最佳提取工藝：提取溶劑選用60%的乙醇，小白蒿與60%乙醇的料液比為1∶25，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為4 h。試驗(yàn)得出的最佳提取工藝可以對(duì)蒙藥小白蒿黃酮類物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的分離提純，進(jìn)而開(kāi)展其他的蒙獸藥開(kāi)發(fā)試驗(yàn)研究工作，為該藥物在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。