孫曉偉，高 慧，董巧香*

(溫州醫(yī)科大學 a檢驗醫(yī)學院 生命科學學院，b公共衛(wèi)生與管理學院，浙江 溫州 325035)

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸(0.1～100 nm)或由其作為基本單元構成的材料[1]，與普通材料相比，它在光學、熱學、電學、磁學、力學以及化學等方面具有獨特的性質[2]。納米銀(silver nanoparticles，AgNPs)是1種粒徑小于100 nm的銀單質，由于其具有良好的抗菌作用，現(xiàn)已成為應用最廣泛的納米產(chǎn)品之一[3-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，納米銀具有一定細胞毒性[5]、肝臟毒性[6]、生殖毒性[7]等生物毒性效應。Ivask等[8]在體外實驗時發(fā)現(xiàn)，不同粒徑的納米銀可以穿過哺乳動物細胞的細胞膜，對細胞產(chǎn)生損傷，粒徑越小，毒性越強。體內實驗表明，納米銀可以通過Balb/c小鼠的胎盤屏障或通過母乳而傳遞給子代，并引起胚胎的發(fā)育異常[9]。

乳腺干細胞(mammary stem cells，MaSCs)是一類成體干細胞，它對于雌性哺乳動物乳腺的發(fā)育十分重要[10]。乳腺上皮細胞分為基底細胞群和管腔細胞群[11]，乳腺干細胞可以分為基底干細胞和管腔干細胞，而乳腺干細胞的異常有可能會誘導形成乳腺癌干細胞，并進一步導致機體發(fā)生癌變。

本研究以FVB-GFP小鼠為實驗動物，對孕期小鼠進行納米銀暴露，研究納米銀對子代小鼠乳腺導管和乳腺干細胞的影響，從而揭示納米銀誘導乳腺癌發(fā)生的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

成年FVB-GFP小鼠購自美國Jackson實驗室，小鼠飼料和飲用水經(jīng)過嚴格檢測，均不含納米銀，可以排除外界因素對本實驗的干擾。

1.1.2 實驗儀器

石蠟切片機購自Leica公司；光學顯微鏡購自尼康公司；流式細胞儀購自BD公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自Thermo公司。

1.1.3 試劑耗材

納米銀、蘇木精、伊紅購自Sigma公司；Epicult-B基礎培養(yǎng)基、Epicult-B Proliferation Supplement、Mammocult基礎培養(yǎng)基和Mammocult Proliferation supplement購自Stem Cell公司；氯化銨溶液、0.25% Trypsin-EDTA、DNase I、Dispase和抗鼠CD24-PE抗體購自Stem Cell公司；抗人/鼠CD49f-PE/Cy7抗體購自Biolegend公司；胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理

將3月齡FVB-GFP雌性小鼠平均分成2組，根據(jù)雌雄比2∶1進行合籠，看到陰道栓的當天記作懷孕第0 d，懷孕第12～18 d進行灌胃處理。將納米銀顆粒放到超純水中，超聲，制成混懸液。處理組每日灌胃50 mg·kg-1納米銀混懸液，對照組灌胃同樣記錄的超純水[12]。

1.2.2 小鼠臟器及乳腺組織的采集與處理

小鼠麻醉后，頸椎脫臼處死。將小鼠腹部向上固定，用外用手術刀剪開外皮，取下左側胸腺處乳腺，放到福爾馬林中，用于石蠟包埋以及病理切片的制備。左側腹股溝處乳腺在玻片上攤平后放到固定液中用于整體染色，右側乳腺消化后制成單細胞懸液。用內用手術刀剪開腹腔膜，取出子宮和肝臟，稱重后，放到福爾馬林溶液中固定。

1.2.3 細胞流式分選

將組織放到消化液中，恒溫培養(yǎng)消化，依次加入氯化銨、胰蛋白酶、中性蛋白酶和DnaseⅠ，得到單細胞懸液。分別加入不同熒光素標記的CD24-PE、Streptavidin-APC、CD49f-PE/Cy7抗體，分選得到不同的細胞群：Lin-CD24+CD49fhi基底干細胞和Lin-CD24hiCD49flo管腔干細胞。

1.2.4 微球和3D培養(yǎng)

將分選得到的不同細胞群按照一定比例種在不含血清的培養(yǎng)基中，5 d后形成微球，計數(shù)并計算微球形成率。在顯微鏡下挑取約50個微球重懸于基底膜基質中，加入含有血清的培養(yǎng)基，9 d后，觀察并記錄3D結構的形態(tài)和大小。

1.2.5 乳腺增生導管的定量分析

將浸泡在福爾馬林中的乳腺組織用石蠟包埋后，4 μm切片，然后經(jīng)過伊紅-蘇木素染色，可以清晰看到乳腺導管的結構。正常的乳腺導管由2層細胞構成，而增生導管細胞層數(shù)發(fā)生明顯紊亂。在顯微鏡下統(tǒng)計正常和增生導管的數(shù)目，計算增生導管的比例。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Graphpad Prism 6軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及T檢驗, 測定結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 對子代小鼠肝臟和子宮的影響

孕期納米銀暴露對子代小鼠肝臟和子宮的影響見圖1。肝臟指數(shù)可以在一定程度上反應藥物的毒性強弱。研究發(fā)現(xiàn)，處理組小鼠肝臟指數(shù)顯著降低，表明納米銀對小鼠產(chǎn)生了顯著的肝臟毒性效應。子宮是雌性哺乳動物重要的生殖器官，它對于乳腺的發(fā)育具有非常關鍵的調節(jié)作用。取出小鼠子宮，測量其長度和直徑，小鼠子宮的長度和直徑并無顯著差異，表明孕期納米銀暴露對子代小鼠的子宮并沒有產(chǎn)生毒性效應。

圖1 小鼠肝臟指數(shù)和子宮形態(tài)變化

2.2 對子代小鼠乳腺形態(tài)的影響

為了觀察納米銀對乳腺形態(tài)的影響，用胭脂紅染液對乳腺組織進行整體染色并觀察(圖2)。正常的乳腺導管具有清晰的二級和三級分支結構，處理后三級結構明顯減少。同時，乳腺組織中的淋巴結可以表征炎癥反應，由圖可以看出處理后淋巴結面積明顯增大，表明孕期納米銀暴露可以引起子代小鼠的炎癥反應。

圖2 小鼠乳腺導管形態(tài)

2.3 對子代小鼠乳腺病理學結構的影響

乳腺組織包埋后4 μm切片，經(jīng)過伊紅-蘇木素染色后，可以清晰看到乳腺導管的細胞組成(圖3)。正常導管由規(guī)則的2層細胞組成，增生后，細胞層數(shù)增多。處理后增生導管的比例并沒有發(fā)生明顯的變化。

上述結果表明孕期納米銀暴露子代乳腺導管并沒有產(chǎn)生明顯的病變。

圖3 小鼠乳腺病理學結構

2.4 對子代小鼠乳腺干細胞組成的影響

根據(jù)不同的細胞表面標記，乳腺干細胞可以分為2個不同的細胞群：基底干細胞群(Lin-CD24+CD49fhi，MRU)和管腔干細胞群(Lin-CD24hiCD49flo，CFC)。處理后，基底干細胞和管腔干細胞占總乳腺上皮細胞的比例并沒有發(fā)生明顯變化，表明孕期納米銀暴露并不會改變子代小鼠乳腺干細胞的組成(圖4)。

圖4 小鼠乳腺干細胞組成變化

2.5 對子代小鼠微球和3D形態(tài)的影響

將分選得到的細胞群進行無血清培養(yǎng)后可以得到乳腺微球結構，統(tǒng)計每1 000個細胞形成的微球個數(shù)(圖5)。研究發(fā)現(xiàn)，處理后管腔干細胞的微球形成率顯著降低，但是基底干細胞的微球形成率沒有發(fā)生變化。將管腔干細胞形成的微球重懸于基底膜基質中，可以形成3D結構。測量3D結構的直徑，并統(tǒng)計空心結構的比例，發(fā)現(xiàn)處理組3D結構的直徑明顯降低，而且空心結構的比例也顯著減少。孕期納米銀暴露可以降低管腔干細胞的微球形成率，并且影響其3D結構的直徑和形態(tài)。

3 討論

納米銀因其具有廣泛的殺菌作用而應用到日常生活的方方面面。研究發(fā)現(xiàn)，納米銀可以通過口服、皮膚接觸、靜脈注射等多種方式進入生物體內，并隨著血液循環(huán)運輸?shù)缴眢w的其他部位[13]。通過嚙齒類動物的體內和體外實驗發(fā)現(xiàn)，納米銀可以產(chǎn)生各種生物毒性效應，并傳遞給子代[14]。

本研究以FVB-GFP轉基因小鼠為實驗動物，在懷孕第12～18 d進行連續(xù)一周的納米銀暴露。處理后子代小鼠的肝臟指數(shù)發(fā)生了顯著的變化，說明納米銀可以產(chǎn)生一定的毒性，但是這種毒性效應并沒有影響子宮的形態(tài)發(fā)育。

有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺導管的分支結構、密度以及病理學結構的異常等都有可能成為乳腺組織發(fā)生病變的參考因素[15]。本實驗中，處理后的乳腺導管二級和三級結構發(fā)生了明顯的異常變化，這說明，孕期納米銀暴露可能是子代乳腺病變甚至發(fā)生癌變的一個危險因素。同時，淋巴結面積的增大說明機體產(chǎn)生了炎癥反應，表明納米銀可能通過炎癥反應使乳腺形態(tài)發(fā)生異常。

在乳腺干細胞的微球和3D形成實驗中，發(fā)現(xiàn)納米銀可以影響管腔干細胞的微球形成率，但是對基底干細胞幾乎沒有影響。通過進一步的3D重懸培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)納米銀可以顯著減小3D結構的直徑，而且其形態(tài)也發(fā)生了明顯的變化。

圖5 小鼠乳腺微球和3D結構形態(tài)

孕期是納米銀暴露的一個敏感窗口。納米銀可以產(chǎn)生肝臟毒性，影響乳腺導管的形態(tài)，對乳腺干細胞尤其是管腔干細胞的發(fā)育與分化具有顯著的影響，這些發(fā)現(xiàn)為乳腺病變或乳腺癌的預防與治療提供了一定的理論參考價值，其機制還有待于我們的進一步探索。