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包蟲(chóng)病又稱(chēng)棘球蚴病(Echinococcosis)，是由棘球絳蟲(chóng)中絳期幼蟲(chóng)感染所致的重要人獸共患疾病。目前，細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusgranulosus)和多房棘球絳蟲(chóng)(E.multilocularis)是兩種最為重要的致病病原，呈世界性分布[1-2]。我國(guó)首次包蟲(chóng)病全國(guó)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)包蟲(chóng)病流行范圍廣，患病數(shù)量和疾病負(fù)擔(dān)均居全球首位[3]。人們通過(guò)誤食蟲(chóng)卵污染的水源和食品等感染，棘球蚴囊可產(chǎn)生占位性病變，其中多房棘球蚴可直接浸潤(rùn)肝組織，使患者肝功能?chē)?yán)重受損，隨著病程的發(fā)展，棘球蚴病嚴(yán)重危害患者生命健康，甚至導(dǎo)致死亡[1]。目前，該病的臨床化療藥物較為局限，僅有甲苯達(dá)唑(mebendazole)和阿苯達(dá)唑兩種，且治愈率均不高[4]，因此尋找新的治療藥物或者治療方案是目前亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。

近年來(lái)，一些廣譜抗寄生蟲(chóng)藥物和抗癌藥物被報(bào)道具有潛在的抗棘球蚴作用，可觀察到其體內(nèi)外對(duì)細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴的作用效果[5-6]。本課題組前期亦對(duì)一些臨床藥物的抗棘球蚴效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，從中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)潛在的治療包蟲(chóng)病藥物。本研究對(duì)臨床治療阿爾茲海默病藥物—他克林(Tacrine)在體外對(duì)細(xì)粒棘球蚴作用進(jìn)行了觀察。

1 材料與方法

1.1蟲(chóng)體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠體重(20±2)g購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)來(lái)源于青海自然感染的綿羊細(xì)粒棘球蚴囊，從囊液中取出的原頭節(jié)用生理鹽水清洗5～8次后棄去囊液及殘留的囊壁組織。用0.1%的亞甲基藍(lán)溶液對(duì)原頭節(jié)進(jìn)行染色，并在倒置顯微鏡下觀察其活性，其中死亡的原頭節(jié)被染成深色，原頭節(jié)活性大于95%的用于后續(xù)的研究。用含有500 U雙抗的生理鹽水調(diào)整細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)密度為4 000個(gè)/ mL，向昆明小鼠腹腔注射0.5 mL原頭節(jié)懸液，模型建立8個(gè)月以上可用于生發(fā)層細(xì)胞的分離。

1.2主要試劑 他克林和甲苯達(dá)唑均購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司， RPMI 1640培養(yǎng)基和其他細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自上海林峰化學(xué)試劑有限公司，亞甲基藍(lán)(methylene blue)購(gòu)自上海三愛(ài)思試劑有限公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自于日本Dojondo公司。

1.3細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)和生發(fā)層細(xì)胞體外培養(yǎng) 將細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)加入完全培養(yǎng)基(PRMI 1640培養(yǎng)基中包含10%胎牛血清、10%囊液、2 mmol/L谷氨酸、1 mmol/L丙酮酸鈉、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL鏈霉素)中，在5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)，每4～5天換液1次。按照每200 μL培養(yǎng)基包含50～200個(gè)原頭節(jié)加入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過(guò)夜后用于藥效觀察實(shí)驗(yàn)。解剖細(xì)粒棘球蚴感染的昆明小鼠，取出其腹腔內(nèi)的囊，用生理鹽水清洗3～5次后經(jīng)37 ℃的2.5%胰酶消化10～30 min后以500 ×g離心5 min后棄上清并加入完全培養(yǎng)基調(diào)整生發(fā)層細(xì)胞密度至5×104個(gè)/mL，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，每2～3 d換液1次。將培養(yǎng)后的生發(fā)層細(xì)胞懸液按照1×104個(gè)/200 μL加入96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過(guò)夜貼壁后可用于藥效觀察實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)和生發(fā)層細(xì)胞體外給藥方案 用DMSO配制的濃度為4、8、10、20和40 μg/mL的他克林分別同細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)和生發(fā)層細(xì)胞在5% CO2，37 ℃條件下進(jìn)行孵育，同時(shí)以0.5% DMSO作為空白對(duì)照。孵育3 d后的原頭節(jié)用0.1%的亞甲基藍(lán)溶液染色并在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，分別記錄死亡原頭節(jié)數(shù)和原頭節(jié)總數(shù)，計(jì)算原頭節(jié)死亡率。原頭節(jié)死亡率(%)=(死亡原頭節(jié)數(shù)目/原頭節(jié)數(shù)目總和)×100%。生發(fā)層細(xì)胞的活性用CCK-8試劑盒測(cè)定，計(jì)算細(xì)胞活性抑制率。細(xì)胞抑制率(%)=[(對(duì)照細(xì)胞活性-藥物作用后細(xì)胞活性)/對(duì)照組細(xì)胞活性]×100%。

1.5透射和掃描電子顯微鏡觀察 將40 μg/mL 他克林作用后的原頭節(jié)和生發(fā)層細(xì)胞置于2.5%的戊二醛4 ℃固定過(guò)夜。透射電鏡實(shí)驗(yàn)步驟：用PBS清洗3次，用2%的鋨酸4度固定2 h，再用PBS清洗3次(每次15 min)，分別用50%、70%、80%和90%乙醇梯度脫水各15 min，再用100%乙醇脫水3次(每次20 min)，丙酮置換2次(每次15 min)后用丙酮：包埋劑(體積比)=2∶1的浸漬液浸漬4 h，再用丙酮：包埋劑(體積比)=1∶2的浸漬液浸漬4 h，用純包埋劑浸漬2次(每次12 h)。將樣品放入盛有純包埋劑的包埋板中置于65 ℃條件下聚合48 h以上，修理包埋頭后制備厚度為70 nm的包埋切片，用乙酸雙氧鈾染色10 min，用檸檬酸鉛染色10 min后上機(jī)檢測(cè)。掃描電鏡實(shí)驗(yàn)步驟：用PBS清洗3次(每次10 min)，分別用30%、50%、70%、80%和90%乙醇梯度脫水各15 min，再用100%乙醇脫水3次(每次15 min)，叔丁醇置換3次(每次30 min)后，用真空冷凍干燥機(jī)干燥樣品過(guò)夜。將樣品用導(dǎo)電膠帶粘到樣品臺(tái)上，用離子濺射儀鍍10 nm金膜后上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1他克林對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的體外作用效果

在倒置顯微鏡下觀察0.1%亞甲基藍(lán)染色后的原頭節(jié)以判斷其活性，其中對(duì)照組中的原頭節(jié)經(jīng)DMSO作用3 d后活性仍然較高(94.28±2.31%)，其形態(tài)未見(jiàn)明顯的改變(圖1A，2A)。不同濃度他克林對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)活性的影響可見(jiàn)圖1A，經(jīng)20 μg/mL和40 μg/mL的他克林作用3 d后，原頭節(jié)的死亡率高達(dá)100%，其中死亡原頭節(jié)的體壁出現(xiàn)輕微腫脹伴隨著外部輪廓的消失(圖2B)。但當(dāng)藥物作用濃度降低至10 μg/mL以下時(shí)，未發(fā)現(xiàn)對(duì)原頭節(jié)活性的影響。

2.2他克林對(duì)細(xì)粒棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞的體外作用效果 他克林對(duì)細(xì)粒棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞活性的影響呈現(xiàn)劑量相關(guān)性(圖1B)，當(dāng)其濃度為40 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞活性的抑制率可達(dá)100%。而當(dāng)他克林濃度降低至20 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活性抑制率減少到(40.42±4.67)%。隨著藥物劑量的進(jìn)一步降低，由他克林造成的生發(fā)層細(xì)胞活性抑制率低于20%。經(jīng)40 μg/mL的他克林作用后3 d后，細(xì)粒棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞粘附于培養(yǎng)介質(zhì)的基質(zhì)消失，同時(shí)伴隨著非正常的細(xì)胞聚集以及細(xì)胞數(shù)目的減少(圖2D)。而在正常狀態(tài)下，生發(fā)層細(xì)胞經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后貼壁生長(zhǎng)，均勻平鋪于培養(yǎng)板(圖2C)。

注：A: 他克林對(duì)原頭節(jié)劑量反應(yīng)關(guān)系曲線；B：他克林對(duì)生發(fā)層細(xì)胞劑量反應(yīng)關(guān)系曲線。圖1 他克林對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)和生發(fā)層細(xì)胞活性的影響Fig.1 Activity of E. granulosus metacestodes and germinal cells treated with tacrine in vitro

注：A：DMSO對(duì)照組正常原頭節(jié)；B：他克林作用3 d原頭節(jié)；C：DMSO對(duì)照組正常生發(fā)層細(xì)胞；D：他克林作用3 d生發(fā)層細(xì)胞。圖2 體外培養(yǎng)的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)和生發(fā)層細(xì)胞經(jīng)40 μg/mL的他克林作用后的形態(tài)變化Fig.2 Morphylogical changes of E. granulosus metacestodes and germinal cells caused by 40 μg/mL tacrine in vitro

2.3透射和掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果 透射電鏡結(jié)果表明，DMSO對(duì)照組的原頭節(jié)形態(tài)正常，其體壁結(jié)構(gòu)完整，包括遠(yuǎn)端胞漿、肌肉束以及糖原儲(chǔ)存細(xì)胞等有序排列(圖3A)。而經(jīng)40 μg/mL的他克林作用3 d后，原頭節(jié)的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變，主要體現(xiàn)在其體壁結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)了大量的空泡和脂肪滴(圖3B)。在掃描電鏡下觀察到DMSO對(duì)照組正常的生發(fā)層細(xì)胞為圓形，其形態(tài)均勻飽滿(mǎn)，通過(guò)粘附基質(zhì)附著于培養(yǎng)板(圖3C)。當(dāng)他克林作用3 d后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，主要表現(xiàn)在細(xì)胞出現(xiàn)塌陷或者萎縮，細(xì)胞粘附基質(zhì)消失(圖3D)。

注：A：DMSO對(duì)照組正常原頭節(jié)；B：他克林作用3 d原頭節(jié)；C：DMSO對(duì)照組正常生發(fā)層細(xì)胞；D：他克林作用3 d生發(fā)層細(xì)胞。圖3 他克林(40 μg/mL)體外作用導(dǎo)致細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)和生發(fā)層細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Ultrastructural changes of Echinococcus granulosus metacestodes and germinal cells caused by 40 μg/mL tacrine in vitro

3 討 論

他克林作為乙酰膽堿酯酶抑制劑，于1994年由美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)上市，用于治療輕到中度阿爾茲海默病[7]。本研究報(bào)道了他克林對(duì)棘球蚴的作用效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明他克林對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)粒棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞和原頭節(jié)的活性均有直接影響，尤其是20 μg/mL和40 μg/mL的藥物濃度可造成大部分寄生蟲(chóng)的死亡。藥物作用可引起原頭節(jié)超微結(jié)構(gòu)的改變，在死亡的原頭節(jié)中可見(jiàn)大量的空泡和脂肪滴，該變化在其他藥物的作用中亦有報(bào)道[8-13]。根據(jù)此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)對(duì)于他克林相較于生發(fā)層細(xì)胞更為敏感，提示其主要通過(guò)影響原頭節(jié)的活性發(fā)揮抗包蟲(chóng)作用效果，因此其不僅有作為抗包蟲(chóng)藥物的潛能，亦可作為原頭節(jié)殺滅劑使用。

目前，治療包蟲(chóng)病的藥物僅有甲苯達(dá)唑和阿苯達(dá)唑兩種，而上述藥物因?yàn)榭诜蛰^差，限制其藥效的進(jìn)一步發(fā)揮。他克林作為臨床治療藥物，其系統(tǒng)的藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，其親脂性的特點(diǎn)使得口服他克林可被機(jī)體快速以及充分吸收[14-15]，可在腎臟、肝臟、膀胱等組織中檢測(cè)到較高的藥物濃度[16]，這些部位都是棘球蚴囊可能的寄生位點(diǎn)，提示其在經(jīng)口服給藥后可在棘球蚴治療靶位點(diǎn)達(dá)到有效藥物濃度，從而實(shí)現(xiàn)治療效果。根據(jù)本研究結(jié)果，他克林的對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的體外作用效果較好，但是需要較高藥物濃度才能對(duì)生發(fā)層細(xì)胞的活性有較強(qiáng)的抑制效果，因此在后續(xù)研究中應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注他克林在治療包蟲(chóng)病的給藥方案的優(yōu)化，尤其聯(lián)合用藥的可能性。據(jù)報(bào)道，在他克林治療阿爾茲海默病的臨床治療中，患者可出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶的升高，但停藥后可恢復(fù)正常。鑒于包蟲(chóng)病藥物治療的特點(diǎn)，通常需要長(zhǎng)期給藥，因而他克林作為抗包蟲(chóng)治療藥物的后續(xù)研究仍需考慮藥物毒性對(duì)治療帶來(lái)的影響。

他克林除了治療阿茲海默病，還對(duì)慢性腦缺血起到一定的保護(hù)作用[17]。其主要的作用機(jī)制為該藥物可通過(guò)抑制突觸間隙內(nèi)乙酰膽堿的降解，從而活化及保護(hù)毒蕈堿和煙堿受體，以此改善患者的膽堿能系統(tǒng)功能，提高其認(rèn)知能力[18]。另外，他克林可抑制K離子和Ca離子通道等一些電壓門(mén)控離子[19]。上述的乙酰膽堿酯酶以及離子通道等是否可作為他克林抗棘球蚴的藥物作用靶點(diǎn)還需進(jìn)一步的研究加以證明。

綜上所述，本研究報(bào)道了他克林對(duì)細(xì)粒棘球蚴的作用效果，探索其作為治療包蟲(chóng)病藥物新藥的應(yīng)用前景。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，他克林作用于體外培養(yǎng)的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)和生發(fā)層細(xì)胞，均表現(xiàn)出顯著的殺滅和抑制效果，提示其是潛在的包蟲(chóng)病治療藥物。