歐小宏，劉迪秋，王麟猛，楊野*，崔秀明*

(1.昆明理工大學(xué)，生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省三七資源可持續(xù)發(fā)展利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；3.國(guó)家中藥管理局三七資源可持續(xù)發(fā)展利用研究室，云南 昆明 650500；4.云南省文山七麒三七科技有限公司，云南 文山 663000)

三七Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen為五加科人參屬植物，具有活血化瘀、消腫定痛等功效，是我國(guó)特有的名貴中藥材。云南是三七的道地主產(chǎn)區(qū)，占總種植面積的98%以上，僅2016年的農(nóng)業(yè)產(chǎn)值就高達(dá)100億元，已成為云南省重要的經(jīng)濟(jì)支柱之一。三七是宿根植物，忌地性極強(qiáng)，三年七收獲后的土地如再次種植(重茬)三七，發(fā)病率可達(dá)90%以上[1]。三七需要間隔(輪作或休閑)8～10年以上才能再次種植[2]。為此，三七種植不得不向非道地產(chǎn)區(qū)的貴州、四川等地?cái)U(kuò)散[3]，嚴(yán)重影響了三七的道地性。

當(dāng)前，廣大學(xué)者對(duì)三七連作障礙產(chǎn)生機(jī)制已有比較全面的認(rèn)識(shí)，其產(chǎn)生原因主要有：(1)土壤微生物群落的改變，病原微生物增加，有益微生物減少，土傳病蟲(chóng)害加劇；(2)化感物質(zhì)引起的自毒作用；(3)土壤鹽漬化和酸漬化加重及土壤養(yǎng)分等理化性狀改變。根據(jù)其產(chǎn)生原因，對(duì)連作土壤進(jìn)行滅菌是防治三七連作障礙的方式之一。如可采用有機(jī)硫熏蒸劑[4]、火燒[5]、臭氧熏蒸[6]等方式對(duì)連作土壤進(jìn)行滅菌。清除三七連作土壤化感物質(zhì)也是防治三七連作障礙的方式之一。如利用小麥與三七輪作可以消除連作土壤中的酚酸類物質(zhì)[7]。此外，改善土壤理化性狀也是防治三七連作障礙的方式之一。如通過(guò)合理的氮磷肥施用量[8]，以及添加土壤改良劑[9]、過(guò)氧化鈣[10]等方式也可緩解三七種植土壤的連做障礙。

目前，土壤熏蒸消毒是防治蔬菜等作物連作障礙最有效的手段[11]。溴甲烷是應(yīng)用最廣且效果最優(yōu)良的防治連作障礙的土壤熏蒸劑，能有效的防除土壤中的病原真菌、細(xì)菌、線蟲(chóng)、地下害蟲(chóng)及雜草等[12-13]。然而，由于溴甲烷對(duì)大氣臭氧層的破壞性，從1997年開(kāi)始逐漸被禁止使用，我國(guó)已于2015年全面禁止溴甲烷的使用[14]。當(dāng)前已出現(xiàn)了各種溴甲烷的替代品，氯化苦就是較好的替代品之一。研究表明，氯化苦熏蒸處理能夠殺死土壤85%以上的細(xì)菌、真菌和放線菌[15]，還對(duì)雜草具有一定的防治效果[16]。2015年農(nóng)業(yè)部14號(hào)公告規(guī)定[17]：禁止殺撲磷、甲拌磷、甲基異柳磷、克百威、氯化苦、溴甲烷使用于蔬菜、瓜果、茶葉、甘蔗、中草藥材等作物，將溴甲烷、氯化苦農(nóng)藥登記的使用范圍變更為土壤熏蒸。雖然氯化苦不能直接用于作物殺菌，但用于土壤熏蒸是安全可靠的，氯化苦在土壤中的半衰期只有0.2～4.5 d[18]，連續(xù)使用對(duì)土壤及農(nóng)作物無(wú)殘留，也無(wú)不良的影響，對(duì)地下水無(wú)污染[19]。我國(guó)山東地區(qū)已廣泛采用氯化苦熏蒸土壤防治姜瘟[20]。因此，利用氯化苦熏蒸土壤防治連作障礙具有十分廣闊的應(yīng)用前景，但其在三七連作障礙防治中的應(yīng)用鮮見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究采用田間小區(qū)試驗(yàn)研究了氯化苦熏蒸處理三七連作土壤，探索了該處理對(duì)連作土壤理化性質(zhì)、三七生長(zhǎng)及品質(zhì)、氯化苦殘留量等的影響，以期為氯化苦在三七連作障礙防治中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)于2015—2016年在云南省文山州文山市平壩鎮(zhèn)進(jìn)行，E：104°8′6.918″，N：23°15′18.458″。試驗(yàn)區(qū)屬中亞熱帶季風(fēng)氣候，海拔1756 m，年均日照時(shí)數(shù)2028 h，年均積溫6 829.3℃，年平均氣溫18.4℃，年均晝夜溫差11.7℃，平均相對(duì)濕度75%，年均降雨量1 187.8 mm，無(wú)霜期323～329 d。供試土壤為紅壤，是種植2年(一輪)三七的連作土壤，中間無(wú)間隔或輪作，基本理化性狀為：pH 6.50，有機(jī)質(zhì)8.42 g·kg-1，全氮 0.81 g·kg-1，堿解氮 88.72 mg·kg-1，全磷 0.94 g·kg-1，有效磷 60.47 mg·kg-1，全鉀 11.22 g·kg-1，速效鉀 170.57 mg·kg-1。

1.2 供試材料

一年生三七幼苗購(gòu)于文山三七市場(chǎng)，復(fù)合肥(N-P2O5-K2O=15∶15∶15，云南云天化國(guó)際化工股份有限公司)，氯化苦(CCl3NO2，大連綠峰化學(xué)股份有限公司)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用田間小區(qū)實(shí)驗(yàn)，小區(qū)規(guī)格為2 m×15 m，設(shè)無(wú)熏蒸和熏蒸兩個(gè)處理，重復(fù)3次。無(wú)熏蒸處理為對(duì)照，即土壤不做任何處理；熏蒸處理為先用氯化苦熏蒸處理土壤，具體操作：將地深翻平整后，氯化苦用量為50 g·m-2，利用專用注射器注射到土壤墑面15 cm土層后，立即覆蓋薄膜對(duì)土壤進(jìn)行熏蒸消毒處理，20 d后揭去薄膜，再自然晾曬15 d，備用。所有三七種植農(nóng)事操作均按照常規(guī)管理進(jìn)行。2015年1月10日按照株行距15 cm×20 cm移栽一年生三七，分別于2015年和2016年3月和7月追施復(fù)合肥2次，追肥量分別為每畝100和120 kg(1畝≈666.7 m2)。三七出苗整齊后，對(duì)各處理每月存苗率進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，于2015年7月(二年生)和2016年12月(三年生)對(duì)三七和土壤進(jìn)行取樣，測(cè)定三七農(nóng)藝性狀、土壤理化性狀、氯化苦殘留量及藥效成分成分含量。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目

1.4.1 存苗率及農(nóng)藝性狀 三七出苗整齊后對(duì)各處理存苗數(shù)進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，由于無(wú)熏蒸處理三七于2015年8月左右已無(wú)存苗，故未對(duì)其2016年三七存苗率和農(nóng)藝性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

(1)

2015年7月(二年生)和2016年12月(三年生)取樣測(cè)定三七株高、葉片長(zhǎng)寬、剪口長(zhǎng)寬、塊根長(zhǎng)寬、須根長(zhǎng)、生物量等農(nóng)藝性狀后，自然風(fēng)干，粉碎，備用。

1.4.2 土壤理化性狀 2015年7月和2016年12月分別取無(wú)熏蒸和熏蒸處理土壤樣品，并測(cè)定其理化性狀。參考《土壤分析技術(shù)規(guī)范(第二版)》[21]，pH采用電位法，交換性酸采用KCl交換-中和滴定法，石灰需要量采用氯化鈣-中和滴定法，陽(yáng)離子交換量采用乙酸銨交換法，有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀-容量法，全氮采用凱氏定氮法，堿解氮采用堿解擴(kuò)散法，全磷采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法，有效磷采用Olsen法，全鉀采用氫氧化鈉熔融-火焰光度法，速效鉀采用乙酸銨浸提-火焰光度法。

1.4.3 土壤微生物數(shù)量 2015年7月和2016年12月分別取無(wú)熏蒸和熏蒸處理土壤樣品，保存于4 ℃冰箱，用于細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量測(cè)定。參考劉星等[22]采用稀釋平板法，真菌采用馬丁培養(yǎng)基，細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌采用高氏1號(hào)培養(yǎng)基。

1.4.4 氯化苦含量測(cè)定

樣品提?。?0 g土壤或植株樣品于具塞三角瓶加50 mL石油醚，冰箱中浸泡過(guò)夜，超聲提取10 min，靜置1小時(shí)，取上清液用氣相色譜測(cè)定。

儀器：Agilent 7890A氣相色譜儀配備Agilent 7694E頂空自動(dòng)進(jìn)樣器和電子捕獲檢測(cè)器，安捷倫公司毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

色譜條件：進(jìn)樣口溫度150 ℃，柱溫60 ℃，保持6 min，檢測(cè)器溫度250 ℃，載氣為高純氮?dú)?，載氣流量20 mL·min-1，分流比30∶1，柱流量1 mL·min-1，尾吹30 mL·min-1。頂空進(jìn)樣器條件：爐箱溫度80 ℃，樣品環(huán)溫度85 ℃，傳輸線溫度90 ℃，瓶加熱時(shí)間3 min，瓶加壓時(shí)間0.1 min，樣品環(huán)填充時(shí)間0.5 min，樣品環(huán)壓力穩(wěn)定時(shí)間0.05 min，進(jìn)樣時(shí)間0.5 min，循環(huán)時(shí)間6 min[19]。

1.4.5 三七素和皂苷含量測(cè)定

三七素提取：取0.5 g三七粉末樣品，加入10 mL超純水，超聲提取15 min，3000 r·min-1離心，重復(fù)提取2次，合并上清液，定容至25 mL，供HPLC用。

HPLC條件：X-Amide色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.2%磷酸(A)-乙腈(B)，洗脫條件：0 min 70% B，10 min 76% B，15 min 80% B， 流速為1.0 mL·min-1， 檢測(cè)波長(zhǎng)213 nm，柱溫24oC，進(jìn)樣量10 μL[23]。

三七皂苷含量測(cè)定皂苷提?。喝?.3 g三七樣品，加25 mL 70% 甲醇浸提過(guò)夜，超聲40 min，3000 r·min-1離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，備用。

HPLC條件：色譜柱為T(mén)hermo Scientific Hypersil GOLD C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為水(A)-乙腈(B)進(jìn)行線性洗脫(V/V)，洗脫條件為0 min 20% B，20 min 40% B，40 min 50% B，50 min 100% B；流速為1 mL·min-1；柱溫為 30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm[24]。

1.4.6 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 18.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯化苦熏蒸處理對(duì)連作三七存苗率及農(nóng)藝性狀的影響

無(wú)熏蒸處理的出苗率，即2015年3月存苗率(65%)比熏蒸處理(88%)低21%；無(wú)論熏蒸與否，三七存苗率均顯著降低，但無(wú)熏蒸處理出苗5個(gè)月后(8月)已全部死亡，熏蒸處理三七存苗率移栽一年后為68%，移栽2年后仍有60%，在移栽第二年內(nèi)基本無(wú)死亡。說(shuō)明氯化苦熏蒸處理連作土壤能夠降低三七死亡率，提高出苗率和存苗率。

注：由于無(wú)熏蒸處理于2015年8月存苗率已為0，故無(wú)熏蒸處理沒(méi)有統(tǒng)計(jì)2016年存苗率。圖1 氯化苦熏蒸處理對(duì)連作三七存苗率的影響±SD，n=3)

無(wú)熏蒸處理三七根系發(fā)育差，須根少且短，而熏蒸處理根系發(fā)育良好，須根多且長(zhǎng)(圖2)。表1也表明，熏蒸處理三七的株高，葉片長(zhǎng)、葉柄長(zhǎng)、須根長(zhǎng)、剪口長(zhǎng)和寬，主根長(zhǎng)和寬，主根生物量等指標(biāo)均顯著或極顯著大于未熏蒸處理，其中主根鮮重增加了84%，主根干重增加了111%。說(shuō)明氯化苦熏蒸處理可以促進(jìn)連作三七生長(zhǎng)，尤其是根系生長(zhǎng)。

注：圖中三七為二年生，取于2015年7月。圖2 氯化苦熏蒸處理對(duì)連作三七生長(zhǎng)狀況的影響

表1 氯化苦熏蒸處理對(duì)連作三七農(nóng)藝性狀的影響

注：無(wú)熏蒸處理于2015年8月存苗率已為0，故2016年無(wú)熏蒸處理無(wú)三七樣品;*和**表示無(wú)熏蒸和熏蒸處理2015年三七農(nóng)藝性狀分別在P<0.05和0.01水平差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 氯化苦熏蒸對(duì)連作三七土壤理化性狀變化的影響

與無(wú)熏蒸處理相比，熏蒸處理連作三七土壤1年后(2015年)，土壤pH、陽(yáng)離子交換量、全磷和全鉀含量均無(wú)顯著變化；交換性酸、石灰需要量、全氮、堿解氮、有效磷含量顯著降低，降幅分別為56%、15%、15%、17%和47%；而有機(jī)質(zhì)和速效鉀含量顯著增加，增幅分別為16%和65%(表2)。與無(wú)熏蒸處理相比，熏蒸處理連作三七土壤2年后(2016年)，土壤pH、石灰需要量、全氮、堿解氮和全鉀含量均無(wú)顯著變化；交換性酸、全磷和有效磷含量顯著降低，降幅分別為39%、31%和52%；而陽(yáng)離子交換量、有機(jī)質(zhì)和速效鉀含量均顯著增加，增幅分別為13%、15%和56%(表2)。說(shuō)明氯化苦熏蒸連作三七土壤可降低其交換性酸、石灰需要量，增加土壤有機(jī)質(zhì)和速效鉀含量，但會(huì)降低土壤氮、磷含量。

表2 氯化苦熏蒸對(duì)連作三七土壤理化性質(zhì)的影響

注：***，**和*分別表示無(wú)熏蒸和熏蒸處理間在P<0.001，P<0.01和P<0.05水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 氯化苦熏蒸對(duì)連作三七土壤微生物數(shù)量變化的影響

與無(wú)熏蒸處理相比，氯化苦熏蒸處理使土壤細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量均顯著降低，其中細(xì)菌數(shù)量2015年和2016年分別降低了50%和37%；真菌數(shù)量2015年和2016年分別降低了19%和28%；放線菌數(shù)量2015年和2016年分別降低了38%和38%(圖3)。說(shuō)明氯化苦熏蒸可以使連作三七土壤細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量減少。

注：***，**和*分別表示無(wú)熏蒸和熏蒸處理間在P<0.001，P<0.01和P<0.05水平上達(dá)到顯著差異。圖3 氯化苦熏蒸處理對(duì)連作三七土壤微生物數(shù)量的影響

2.4 氯化苦熏蒸處理對(duì)氯化苦殘留的影響

無(wú)論熏蒸與否，在土壤和植株中均未檢測(cè)到氯化苦(表3，圖4)，說(shuō)明氯化苦熏蒸連作三七土壤不會(huì)造成氯化苦在土壤和植株中的殘留。

表3 氯化苦熏蒸處理對(duì)連作三七土壤及植株氯化苦殘留量的影響

注：N.D.表示未檢出。

2.5 氯化苦熏蒸處理對(duì)連作三七地下部分有效藥用成分含量的影響

表4表明，與無(wú)熏蒸處理相比，氯化苦熏蒸處理對(duì)連作三七地下部分三七素、三七皂苷R1和人參皂苷Rb1含量均無(wú)顯著影響，但顯著降低了人參皂苷Re含量，顯著增加了人參皂苷Rd含量，但對(duì)這5種皂苷的總和無(wú)顯著影響。說(shuō)明氯化苦熏蒸連作三七土壤不會(huì)影響三七有效藥用成分含量。

注：a.氯化苦標(biāo)準(zhǔn)品；b.土壤樣品；c.三七植株樣品。圖4 氯化苦氣相色譜圖

表4 氯化苦熏蒸對(duì)連作三七藥用成分含量的影響

注：由于無(wú)熏蒸處理于2016年已無(wú)存活，故二年生三七取于2015年7月，熏蒸處理三年生樣品取于2016年12月；*表示無(wú)熏蒸和熏蒸處理之間二年生三七藥用成分含量在P<0.05水平差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

3.1 氯化苦熏蒸對(duì)連作三七存苗率及土壤理化性狀影響

連作三七發(fā)病率在90%以上[1]，主要是因?yàn)榉N植三七會(huì)使土壤微生物組成發(fā)生變化[2，25-26]、土壤養(yǎng)分失衡[27-28]等。張子龍等研究發(fā)現(xiàn)連作三七土輪作7年后三七存苗率可以達(dá)到60%，土壤中細(xì)菌數(shù)量降低，放線菌數(shù)量增加[2]。歐小宏等也發(fā)現(xiàn)通過(guò)“調(diào)酸，減氮，保磷，增鉀，補(bǔ)充微量元素”的施肥方式，以及添加甘蔗渣作為土壤改良劑，可以提高連作三七的存苗率達(dá)31.6%[9]。本研究表明，氯化苦熏蒸處理連作三七土壤后，三七移栽一年后的存苗率達(dá)到68%，移栽2年后存苗率達(dá)到60%(圖1)。該結(jié)果與連作三七土輪作7年后的存苗率(60%)相似[2]，說(shuō)明氯化苦熏蒸連作三七土壤可以縮短連作三七土壤的輪作時(shí)間。一方面是因?yàn)槁然鄬?duì)土壤微生物的殺滅率在85%以上[15]，在短期內(nèi)微生物會(huì)呈現(xiàn)“抑制-恢復(fù)”的趨勢(shì)[29]，從而使有益與有害微生物的數(shù)量趨于平衡。本研究結(jié)果表明，氯化苦熏蒸處理使連作三七土壤細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量顯著降低(圖3)，與尋路路[30]發(fā)現(xiàn)三七健康株根際土細(xì)菌數(shù)量顯著低于病株根際土，而真菌數(shù)量顯著高于病株根際土的結(jié)果相似。另一方面是因?yàn)槁然嘌裟軌驓⑺劳寥乐形⑸?，打破了土壤礦質(zhì)元素的礦化與微生物固持之間的平衡，使其礦化作用大于固持作用，從而可以提高土壤中礦質(zhì)元素含量[31-32]，有利于連作三七土壤養(yǎng)分平衡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯化苦熏蒸處理使連作三七土壤中氮、磷含量顯著降低(表2)，該結(jié)果與張子龍等[2]研究發(fā)現(xiàn)連作三七土壤輪作7年后土壤氮、磷含量降低相似，但與馬濤濤等[31]和顏冬冬等[32]發(fā)現(xiàn)氯化苦熏蒸使土壤氮含量升高相反。主要原因可能是熏蒸處理連作土壤后再種植三七，土壤中的氮磷鉀被三七植株吸收帶走；不熏蒸處理直接種植，三七在移栽后8個(gè)月內(nèi)全部死亡，土壤中氮磷養(yǎng)分大部分仍保留在土壤中，從而增加了養(yǎng)分的微生物固持量。此外，本研究還表明氯化苦熏蒸處理降低了連作三七土壤交換性酸、石灰需要量(表2)，這也是導(dǎo)致連作三七存苗率較高的原因。因?yàn)槿叻N植使土壤酸化是導(dǎo)致連作障礙的原因之一，通過(guò)添加石灰調(diào)節(jié)土壤酸性可以使三七的存苗率增加[9]。

3.2 氯化苦熏蒸對(duì)連作三七產(chǎn)量及品質(zhì)影響

3.3 土壤及三七藥材氯化苦殘留

本研究表明氯化苦熏蒸處理連作三七土壤，不會(huì)導(dǎo)致氯化苦在三七植株中殘留(表3，圖4)，結(jié)果與氯化苦熏蒸土壤后種植黃瓜和番茄，其果實(shí)中也不會(huì)有氯化苦殘留的結(jié)果一致[36]；也不會(huì)導(dǎo)致氯化苦在土壤中殘留(表3，圖4)，因?yàn)槁然嗟陌胨テ趦H0.2～4.5 d，11天后在土壤中基本檢測(cè)不到氯化苦殘留[37]。雖然氯化苦對(duì)土壤進(jìn)行熏蒸消毒具有操作簡(jiǎn)單、不會(huì)對(duì)土壤和作物造成殘留等優(yōu)點(diǎn)，但也需要注意氯化苦具有極高的蒸汽壓，對(duì)人體眼睛、黏膜、肺以及皮膚具有強(qiáng)烈的刺激性[38]。所以為防止因氯化苦散發(fā)而降低熏蒸效果，以及對(duì)人體的危害，利用氯化苦對(duì)連作三七土壤進(jìn)行熏蒸消毒時(shí)，應(yīng)將氯化苦施入土層并立即覆蓋薄膜防止其揮發(fā)；操作人員要嚴(yán)格按照操作規(guī)范進(jìn)行土壤消毒作業(yè)。此外，加強(qiáng)機(jī)械作業(yè)、研發(fā)新劑型等也將是氯化苦在三七連作障礙防治中需要加強(qiáng)的研究方向。綜上，氯化苦在三七連作障礙防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

氯化苦熏蒸連作三七種植土壤，可以顯著增加種植三七的存苗率，促進(jìn)三七生長(zhǎng)，而且不會(huì)對(duì)三七造成氯化苦殘留，也不會(huì)影響三七有效藥用成分的含量。因此，氯化苦對(duì)于三七連作障礙的防治具有良好的效果，建議在生產(chǎn)中根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整使用。