白雪潔，于淼，劉秀華

(1.長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031；2.長(zhǎng)春三德天晟科技有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130012；3.吉林省吉測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130117)

1 儀器與試劑

Agilent 1220型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫)；KQ-250型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ME204E電子天平(梅特勒-托利多)。

純凈水(娃哈哈)，甲醇(色譜純)，其他試劑均為分析純。橙皮苷、黃芩苷、黃芩素、大黃素、大黃酚對(duì)照品(含量均大于99%，批號(hào)分別為110721-201014、110715-201016、111595-200905、110756-200110、110796-201017，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。芩枳丸(規(guī)格為：5.4 g/袋；批號(hào)分別為S1：V01020，S2：V01021，S3：V01022，S4：V01023，S5：V01024，S6：T01005，S7：T01006，S8：T01007，S9：T01008，S10：T01009)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent 1220型高效液相色譜儀，Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5m)色譜柱；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)；流速：1.0 mL·min-1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取芩枳丸1袋，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取橙皮苷、黃芩苷、黃芩素、大黃素、大黃酚對(duì)照品適量，精密稱定，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1.0 mL置于同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.060、0.098、0.008、0.012、0.025 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 多指標(biāo)含量測(cè)定方法學(xué)

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別吸取2.2.2混合對(duì)照品溶液2、4、8、12、16、20 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以各對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算得線性方程。結(jié)果表明各對(duì)照品在相應(yīng)進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 回歸方程與線性范圍

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品(S3)溶液，分別于0、4、8、12、24、48 h按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果橙皮苷、黃芩苷、黃芩素、大黃素、大黃酚含量的RSD分別為1.2%、0.7%、1.6%、1.4%、1.3%。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一供試品(S3)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果橙皮苷、黃芩苷、黃芩素、大黃素、大黃酚含量的RSD分別為1.1%、0.6%、1.1%、1.2%、1.2%。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品(S3)按2.2.1項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果橙皮苷、黃芩苷、黃芩素、大黃素、大黃酚含量的RSD分別為1.7%、0.9%、1.4%、1.2%、1.4%。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取橙皮苷對(duì)照品17.54 mg、黃芩苷對(duì)照品32.02 mg、黃芩素對(duì)照品2.82 mg、大黃素對(duì)照品3.14 mg、大黃酚對(duì)照品7.52 mg于同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。取已知含量的同一批芩枳丸(S3)6份各約0.25 g，精密稱定，分別加入上述橙皮苷、黃芩苷、黃芩素、大黃素、大黃酚混合對(duì)照品1 mL，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)行加樣回收率考察，橙皮苷、黃芩苷、黃芩素、大黃素、大黃酚的平均回收率結(jié)果見表3。

2.3.6 樣品含量測(cè)定 精密稱取10批芩枳丸樣品，分別按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算橙皮苷、黃芩苷、黃芩素、大黃素、大黃酚的含量，結(jié)果見表4。

表3 芩枳丸中5種成分加樣回收率試驗(yàn)( n=6)

表4 10批芩枳丸中5種成分含量測(cè)定結(jié)果

注：A.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；1.橙皮苷；2.黃芩苷；3.黃芩素；4.大黃素；5.大黃酚。圖1 芩枳丸及對(duì)照品高效液相色譜圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)乙腈-磷酸溶液及甲醇-磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行了考察[5-9]，甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相的梯度洗脫系統(tǒng)，洗脫能力強(qiáng)，色譜信息量大，分離度較好，因此選擇甲醇-0.1%磷酸溶作為流動(dòng)相系統(tǒng)?？疾炝瞬煌瑥S家及型號(hào)的色譜柱，Diamonsil(鉆石)C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、ACE C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，選定了Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，該色譜柱對(duì)芩枳丸的分離效果較好。采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)檢測(cè)，在260 nm時(shí)，各峰比例適中，故選擇以 260 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于同時(shí)測(cè)定芩枳丸中橙皮苷、黃芩苷、黃芩素、大黃素、大黃酚的含量。