王小平，楊麗珠，夏玉蘋，陳育青，王瓊珺，謝偉容

(1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建 漳州 363000；2.江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，江西 撫州 344000)

白術(shù)為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的根莖，具健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之功能[1]。白術(shù)最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，作為土炒炮制法代表藥物之一，土炒白術(shù)在歷代醫(yī)書中多有記載，如《本草蒙筌》“陳壁土制，竊真氣驟補中焦”[2-3]。清代名醫(yī)傅山在《傅青主女科·女科卷》收錄80首方中，使用白術(shù)的方劑有48首，其中白術(shù)土炒就占有45首[4]。據(jù)現(xiàn)代研究，土炒輔料可協(xié)同增強白術(shù)的健脾止瀉作用，并實驗證明土炒白術(shù)組方的參苓白術(shù)散對降低脾虛小鼠的腹瀉指數(shù)及提高脾虛小鼠的脾虛指數(shù)的作用強于麩炒白術(shù)[5-6]。但由于炮制輔料土來源復(fù)雜，各地土炒工藝及評價標(biāo)準不統(tǒng)一，土炒白術(shù)飲片質(zhì)量良莠不齊，影響臨床安全有效用藥。因此，為考察市場上土炒白術(shù)飲片質(zhì)量情況，本實驗收集了全國不同產(chǎn)地的10批白術(shù)土炒品，研究比較其中所含化學(xué)成分差異，為其質(zhì)量評價及臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國)；METTLER-TOLEDO AB265-S型電子分析天平(瑞士)；FST-Ⅲ-10 精密型超純水機(上海富詩特)；OHAUS AR2140電子分析天平(上海)；KQ5200超聲波清洗器(昆山)。

1.2 材料

土炒白術(shù)炮制品，購自福建、江西、安徽、四川等全國不同地區(qū)，經(jīng)本院中藥教研室陳育青副教授鑒定為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖的土炒加工品，樣品詳細信息見表1；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ(批號：MUST-17030201)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ(批號：MUST-17030202)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(批號：MUST-17030203)，購自成都曼斯特生物科技有限公司，含量≥99%；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004A，國家藥典委員會)；試劑除HPLC用乙腈為色譜純外，其他均為分析純。

表1 不同產(chǎn)地土炒白術(shù)樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～20 min：45% A→70% A；20～40 min：70% A→85% A；40～50 min：85% A→55%A)；50～60 min：55% A→45% A)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：242 nm；柱溫：30 ℃。

2.2 試液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ各適量，加甲醇制成每1 mL分別含65.10、83.20、60.15 μg的混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取土炒白術(shù)樣品適量，粉碎過60目，精密稱取2 g，置錐形瓶中，精密加入甲醇40 mL，密塞，精密稱重，超聲提取(功率200 W，頻率40 kHz)45 min，取出，再稱重，補足減失重量，取上清液，臨用前用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 測定法

分別吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄60 min色譜圖，結(jié)果見圖1。

注：a.白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ；b.白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ；c.白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ；R.參照物；S.白術(shù)土炒品。圖1 白術(shù)土炒品HPLC指紋圖譜

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液(土炒白術(shù)樣品S1)注入高效液相色譜儀，按照2.1項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，將圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，結(jié)果各樣品相似度均大于0.99，RSD為0.28%。各主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積值的RSD值分別在0.06%～0.25%和0.37%～0.62%之間，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取土炒白術(shù)樣品S1共6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件，分別進樣，記錄色譜圖，將圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，結(jié)果各樣品相似度均大于0.98，RSD為0.60%。各主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積值的RSD值分別在0.08%～0.49%和0.59%～1.81%之間，表明該分析方法重現(xiàn)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(土炒白術(shù)樣品S1)，按照2.1項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、24 h進樣，記錄色譜圖并積分，將圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)處理，結(jié)果各樣品相似度均大于0.98，RSD為0.74%。各主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積值的RSD值分別在0.07%～0.60%和0.51%～1.16%之間，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 土炒白術(shù)HPLC指紋圖譜的建立

2.5.1 土炒白術(shù)HPLC指紋圖譜采集 分別取10批不同土炒白術(shù)樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，并按2.1項下色譜條件進行測定，記錄10批樣品HPLC 色譜圖，將其導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，得土炒白術(shù)累加圖譜，見圖2。

2.5.2 指紋圖譜共有峰的標(biāo)定 以中位數(shù)法生成對照指紋圖譜，設(shè)定時間窗寬度為0.30 min，軟件自動匹配圖譜，將10批次土炒白術(shù)樣品圖譜都匹配的色譜峰標(biāo)定為共有指紋圖譜峰。結(jié)果本研究共標(biāo)定有13個共有指紋峰，同時建立對照指紋圖譜，見圖3。根據(jù)參照物色譜峰，可知7號為白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ峰，其在指紋圖譜中保留時間及峰面積適當(dāng)，故選用其(S號峰)作為參照峰，見圖3。

2.5.3 相似度評價 以參照峰的保留時間和峰面積作為1，分別計算不同土炒白術(shù)樣品共有峰的相對保留時間和相對峰面積，見表2、表3。依指紋圖譜相似度軟件計算10批不同土炒白術(shù)樣品HPLC 指紋圖譜相似度，見表4。

注：S1～S10.10批不同土炒白術(shù)；R.對照圖譜。圖2 土炒白術(shù)樣品疊加譜及對照指紋譜

注：峰3.白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ；峰7.白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ；峰10.白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ。圖3 10批土炒白術(shù)樣品HPLC指紋圖譜共有峰

表2 不同產(chǎn)地白術(shù)土炒品共有峰相對保留時間

表3 不同產(chǎn)地白術(shù)土炒品共有峰相對峰面積

表4 不同產(chǎn)地白術(shù)土炒品HPLC指紋圖譜相似度計算結(jié)果

注：S對*為對照指紋圖譜。

由表4可知，不同產(chǎn)地白術(shù)土炒品之間的指紋圖譜相似度值存在差異性。與對照指紋圖譜相比較，江西樟樹(S2)、河北安國(S3)、福建漳州(S4)、福建漳州(S5)、浙江磐安(S8)、四川樂山(S9)、安徽亳州(S10)等土炒品相似度值均在0.85以上，而廣東普寧(S1)、福建漳州(S6)、江蘇蘇州(S7)等相似度值均在0.6以下。

2.6 系統(tǒng)聚類分析(HCA)

將各色譜峰面積相對于稱樣量量化，利用SPSS 19.0分析軟件對樣品進行系統(tǒng)聚類分析，采用組間平均數(shù)聯(lián)接法，以平方歐氏距離作為樣品相似度的距離公式。結(jié)果10個樣品基本可分為3大類(見圖4)，S3、S4、S5、S8、S9聚為第1類，S1、S6、S7聚為第2類，S2、S10聚為第3類。

圖4 不同產(chǎn)地白術(shù)土炒炮制品聚類譜系圖

2.7 樣品主成分分析(PCA)

分別將10批樣品各色譜峰峰面積輸入Excel 表格內(nèi)，得到批數(shù)×色譜峰數(shù)的數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件中進行PCA分析(見圖5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 批樣品基本可分為3 組，樣品S1、S6、S7 為1類，S2、S10 為1類，S3、S4、S5、S8、S9為1類，與系統(tǒng)聚類分析結(jié)果一致。

圖5 不同產(chǎn)地白術(shù)土炒炮制品主成分分析得分散點圖

2.8 偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)

為確定各樣品組間差異性，采用PLS-DA模式識別方法，篩選出組間成分差異貢獻率較大的共有峰。分別將10批樣品共有峰峰面積輸入Excel 表格內(nèi)，得到批數(shù)×共有色譜峰數(shù)(10×13)的數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件中進行PLS-DA模型擬合，并分析生成差異性標(biāo)記物的變量重要性投影值(variable importance in the projection，VIP)圖(見圖6)，其中VIP>1的成分有5個，影響大小依次為峰5、峰7(白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ)、峰10(白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ)、峰3(白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ)、峰11，表明這些成分是不同產(chǎn)地白術(shù)土炒品之間成分差異的主要標(biāo)記物，對其質(zhì)量差異的影響較大。

圖6 不同產(chǎn)地白術(shù)土炒品差異性變量VIP圖

3 討論

本實驗對不同提取溶劑(甲醇、50%甲醇)、不同提取時間(30 、45、60 min)和超聲(功率200 W，頻率40 kHz)、回流兩種提取方法進行比較，結(jié)果表明甲醇超聲45 min 提取的供試品溶液色譜峰數(shù)多，組分含量高。

由實驗結(jié)果分析，不同產(chǎn)地土炒白術(shù)樣品內(nèi)含化學(xué)成分的存有差異，而其藥效成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ等又是成分差異主要標(biāo)記物，影響其臨床組方藥效。因此，為提高中藥飲片的安全性、有效性，應(yīng)增加土炒白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ等內(nèi)酯類成分的含量控制。

土是固體炮制輔料中最特殊的一類，其不僅作為傳熱體，而且通過在中藥飲片表面“掛土色”而與飲片一起入藥，是最能體現(xiàn)傳統(tǒng)“藥輔合一”的制藥理念?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》：“土者脾也，生萬物而法天地?！薄侗静菥V目》：“土者，五行之主，……，在人則脾胃應(yīng)之，故諸土入藥，皆取其裨助戊已之功?！薄毒霸廊珪贰俺匆员谕?，欲助其固?！蹦壳埃o料土可選用伏龍肝、壁土、黃土、紅土、白土、紅磚粉、赤石脂等[4,7-8]，性質(zhì)效用不一，是導(dǎo)致土炒白術(shù)質(zhì)量差異大的主要原因。根據(jù)土炒炮制目的，伏龍肝是最符合傳統(tǒng)炮制意圖的輔料。因此，加強土炒炮制輔料研究，是傳承中藥特色土炒炮制方法亟待解決的課題。