黃文靜，孫曉春，周瑞，張嚴(yán)磊，謝培，李鉑，王二歡，唐志書*

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；2. 陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710077)

黃芪是豆科黃芪屬植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranceus(Fisch.)Bge.的干燥根，為我國常用大宗藥材[1]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，黃芪具有補氣固表，斂瘡生肌，利尿托毒等功效[2-3]，在歸脾丸、降糖丸、參茸白鳳丸、龜鹿補腎丸、補中益氣丸、產(chǎn)復(fù)康顆粒等經(jīng)典組方中均有黃芪，其應(yīng)用十分廣泛[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為黃芪有效成分具有強心降壓、保護血管、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖等功能[4]。據(jù)報道，黃芪藥材主要活性成分為黃酮類物質(zhì)，具有顯著的促進細胞增殖和抗氧化等活性[5]。目前已從黃芪藥材中分離出30多種黃酮類物質(zhì)，包括芒柄花素、毛蕊異黃酮和紅車軸草異黃酮等[6]。

我國內(nèi)蒙古、山西、甘肅、青海和陜西北部均有種植黃芪的傳統(tǒng)，其產(chǎn)區(qū)分布十分廣泛，由于市場對黃芪的需求量逐年增加，種植規(guī)模還在不斷擴大[7]。通過前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪莖葉中含有大量的黃酮類化合物，但每年藥材采挖后地上莖葉往往丟棄，因此造成巨大的浪費。本研究在前期實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪莖葉總黃酮提取工藝，同時對其進行抗炎活性分析，以期為黃芪莖葉黃酮類物質(zhì)的開發(fā)和深層次利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

本實驗用黃芪經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤研究員鑒定為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiao和膜莢黃芪Astragalusmembranceus(Fisch.)Bge.混交種，其地上部分莖葉于9月上旬采自甘肅省隴南市宕昌縣阿塢鄉(xiāng)麻界村黃芪種植基地。將割取的黃芪莖葉置于陰涼處晾干，粉碎機粉碎后裝于塑料袋中避光密封保存。

95%乙醇、無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉和Tris等化學(xué)試劑購于陜西樂博生化試劑有限公司，均為分析純；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購于陜西標(biāo)普醫(yī)藥科技有限公司；96孔細胞培樣板(Corning 公司)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco 公司)，溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)為美國 Sigma 公司產(chǎn)品，Griess 試劑購自北京華奧正生公司，小鼠巨噬細胞系RAW264.7購于中國科學(xué)院上海細胞庫。

高速粉碎機(廣州美的)、UV-2600紫外分光光度計(日本島津)、HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海一恒)、電子天平(北京賽多利斯)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊)、RE-200A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器)、超聲波儀(昆山超聲儀器有限公司)、CO培養(yǎng)箱(賽默飛世爾)、SW-CJ-10潔凈工作臺(蘇州安泰)、Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀。

2 方法

2.1 總黃酮含量測定

總黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[8]。以蘆丁作為對照品，于510 nm 處測定不同濃度蘆丁溶液的吸光值，以吸光度值(Y)為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：Y=9.322 9X-0.003 9(r=0.998 8)。

稱取干燥黃芪莖葉粉末20 g，用醇提法進行提取。將醇提物烘干后加入50 mL 無水乙醇溶解，以無水乙醇為空白，取1 mL 醇溶液在510 nm處測定吸光度值，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮含量。

樣品提取率(%)=0.0025X×100%

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2.2 總黃酮提取工藝

黃芪莖葉總黃酮提取的工藝流程。樣品粉碎→過40目篩→稱重→加入乙醇→超聲提取30 min→回流提取90 min→抽濾→減壓濃縮→烘箱烘干→提取物浸膏。

2.3 單因素試驗

在固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、液料比15∶1、提取溫度為60 ℃、超聲功率為100 W的條件下，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)、提取溫度(50、60、70、80、90 ℃)、超聲功率(50、100、150、200、250 W)對黃芪莖葉總黃酮得率的影響。

2.4 黃芪莖葉總黃酮提取工藝優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法進行提取工藝條件的優(yōu)化[9-10]。選取乙醇濃度、液料比、提取溫度、超聲功率4個因素為自變量，以總黃酮得率為響應(yīng)值，進行四因素三水平實驗設(shè)計，試驗因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2.5 黃芪莖葉總黃酮體外抗炎性評價

黃芪莖葉總黃酮體外毒性試驗采用MTT法，以提取物處理下巨噬細胞RAW264.7的細胞存活率表示毒性大小。按照趙燦等[11]的方法，采用經(jīng)典的Griess 試劑來檢測亞硝酸鹽，從而測定出總NO 濃度。取對數(shù)生長期的巨噬細胞RAW264.7，以地塞米松為對照藥品使用LPS誘導(dǎo)其產(chǎn)生NO，于酶標(biāo)儀上測定550 nm處吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各處理NO濃度，計算NO抑制率[12]。

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2.6 數(shù)據(jù)處理

各指標(biāo)測定的數(shù)據(jù)用Excel處理作圖，采用Design-Expert 8.0軟件處理得響應(yīng)面分析結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1 乙醇濃度對黃芪莖葉總黃酮得率的影響 如圖1所示，隨著乙醇濃度的增加黃芪莖葉總黃酮得率逐漸增高，當(dāng)乙醇濃度大于70%時黃酮得率保持在3.3%左右，遠高于50%和60%乙醇濃度下的總黃酮得率，乙醇濃度為90%時總黃酮得率最高為3.49%。

圖1 乙醇濃度對黃芪莖葉總黃酮得率的影響

3.1.2 液料比對黃芪莖葉總黃酮得率的影響 如圖2所示，黃芪莖葉總黃酮得率隨著乙醇用量的增加呈先增高后降低的趨勢，液料比為15∶1時黃酮得率最大為2.96%，而液料比30∶1時總黃酮得率僅為2.35%，由此可見高乙醇用量并不能使總黃酮得率增加，從降低成本考慮后續(xù)試驗選擇液料比為15∶1最為適宜。

圖2 液料比對黃芪莖葉總黃酮得率的影響

3.1.3 溫度對黃芪莖葉總黃酮得率的影響 由圖3可知，當(dāng)提取溫度在60～70 ℃之間時總黃酮得率最高，較低溫度下(50 ℃)總黃酮的得率僅為2.78%，溫度過高(>80 ℃)也不利于總黃酮的提取，這有可能是黃酮在高溫下的性質(zhì)不穩(wěn)定所致。

圖3 溫度對黃芪莖葉總黃酮得率的影響

3.1.4 超聲功率對黃芪莖葉總黃酮得率的影響 由圖4可知，在所試驗的超聲功率范圍內(nèi)，總黃酮得率與超聲功率呈正相關(guān)關(guān)系，超聲功率越大黃酮得率越高，超聲功率50W時總黃酮得率僅為2.26%，而超聲功率200W時總黃酮得率高達3.35%。

圖4 超聲功率對黃芪莖葉總黃酮得率的影響

3.2 黃芪莖葉總黃酮提取工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，按表1所示的因素和水平采用響應(yīng)面法設(shè)計進行后續(xù)試驗。

3.2.1 回歸模型的建立與檢驗 采用Design-Expert 8.0軟件處理表2數(shù)據(jù)，進行多元回歸擬合后得到總黃酮得率(Y)與乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取溫度(C)和超聲功率(D)的回歸方程：Y=8.65-0.11A+0.34B+0.26C-0.28D+0.15BA-0.05AC-0.17AD+0.81BC+ 0.12BD+0.085CD-1.64A2-1.84B2-1.33C2-2.80D2。該方程中各一次項系數(shù)的絕對值和正負(fù)值分別代表該因素對響應(yīng)值影響的大小和方向，各因素按影響大小排序依次為B>D>C>A，液料比對黃酮得率影響最大，乙醇濃度的影響最小。該方程的二次項系數(shù)為負(fù)值，推斷方程響應(yīng)面的開口向下，具有極值點，對該方程進行方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面分析方案和試驗結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

3.2.2 響應(yīng)面交互分析 通過固定四個因素其中的兩個因素為零水平，可繪制響應(yīng)面和等高線，直觀地考察其他兩因素的交互效應(yīng)對總黃酮得率的影響[13-14]。在所得響應(yīng)面圖中，曲面越陡峭，則該因素對總黃酮得率的影響越顯著；等高線圖與響應(yīng)面圖相對應(yīng)，等高線圖形狀越接近橢圓形，表明兩個因素間的交互作用越強[15]。由圖5～10可以看出，提取溫度和乙醇濃度的響應(yīng)曲面較為平緩，表明其交互作用較弱(圖6)；液料比和乙醇濃度、超聲功率和乙醇濃度、提取溫度和液料比、超聲功率和液料比、超聲功率和提取溫度的響應(yīng)曲面(圖5、圖7～10)均較為陡峭，表明這些因素之間的交互作用較強；圖7、圖9和10圖的等高線圖最接近于橢圓形，說明超聲功率和乙醇濃度、液料比以及提取溫度之間的交互作用最強。由此可見，在黃芪莖葉總黃酮的提取過程中，除提取溫度和乙醇濃度之外，不同因素之間的相互影響較強，對總黃酮的得率存在著一定的協(xié)同作用，其中尤其要考慮到超聲功率的影響。

3.2.3 最佳條件優(yōu)化及驗證 通過對3.2.1所得的回歸方程分析，所得黃芪莖葉總黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度79.71%，液料比15.59∶1，提取溫度71.32 ℃，超聲功率197.77 W，在此工藝條件下所得的總黃酮的理論值為8.69%。為驗證此條件的準(zhǔn)確性，本著節(jié)約成本和試驗操作的便利，將上述條件修正為乙醇濃度80%、液料比15∶1、溫度70 ℃、超聲功率200 W，在此條件下，重復(fù)實驗3次，總黃酮得率為8.58%，表明該優(yōu)化后的工藝參數(shù)能很好地提取黃芪莖葉總黃酮。

圖5 液料比和乙醇濃度響應(yīng)曲面

圖6 提取溫度和乙醇濃度響應(yīng)曲面

圖7 超聲功率和乙醇濃度響應(yīng)曲面

圖8 提取溫度和液料比響應(yīng)曲面

圖9 超聲功率和液料比響應(yīng)曲面

圖10 超聲功率和提取溫度響應(yīng)曲面

3.3 黃芪莖葉總黃酮的抗炎活性

3.3.1 細胞毒性 采用MTT法測定了黃芪莖葉總黃酮對RAW264.7細胞存活率的影響，如圖11所示，總黃酮濃度在1～50 μg·mL-1范圍內(nèi)對RAW264.7細胞存活率的影響無顯著差異，說明在此濃度范圍內(nèi)黃芪莖葉總黃酮對細胞無毒性。當(dāng)總黃酮濃度達100 μg·mL-1時細胞存活率顯著下降，說明在此高濃度下，總黃酮對細胞產(chǎn)生毒害。

注：*.代表與對照組差異顯著( P<0.05)。圖11 不同濃度總黃酮處理對細胞存活率的影響

3.3.2 抗炎活性 如圖12所示，正常狀態(tài)下RAW264.7細胞的NO釋放量在5 μmol·L-1左右，加入黃芪莖葉總黃酮后，NO的釋放受到明顯抑制?？傸S酮濃度在1～50 μg·mL-1時，NO釋放量與對照組差異達極顯著水平；隨著黃酮添加濃度的增加，NO的釋放量不斷升高，當(dāng)處理濃度為100 μg·mL-1時，NO釋放量升高至4.52 μmol·L-1，這可能是高濃度的總黃酮產(chǎn)生了一定的細胞毒性所致。

注：**. 代表與對照組差異極顯著( P<0.01)；*.代表與對照組差異顯著( P<0.05)。圖12 不同濃度總黃酮處理對NO釋放量的影響

如圖13所示，LPS能夠極顯著的誘導(dǎo)RAW264.7細胞NO增加，LSP處理后NO的釋放量由4.89 μmol·L-1上升至21.89 μmol·L-1，增加約4倍。黃芪莖葉總黃酮的加入除能夠降低細胞本底NO水平外(圖12)，還顯著地抑制了由LPS所引起的NO釋放量的增加，隨著總黃酮濃度的增加細胞NO濃度不斷降低，存在明顯的劑量效應(yīng)。在LPS誘導(dǎo)下向RAW264.7細胞加入100 μg·mL-1總黃酮和加入對照藥品20 μg·mL-1地塞米松所產(chǎn)生的NO釋放量差異不顯著，說明黃芪莖葉總黃酮有較為明顯的抗炎活性。

圖13 LPS誘導(dǎo)與不同處理對NO釋放量的影響

4 結(jié)論與討論

本研究通過響應(yīng)面法分析得到黃芪莖葉總黃酮提取的最佳工藝：乙醇濃度80%，液料比15∶1，提取溫度70 ℃，超聲功率200 W，在此技術(shù)參數(shù)下總黃酮得率為8.58%。超聲功率與乙醇濃度、液料比和提取溫度等因素之間的交互影響很強，與前期未經(jīng)超聲波處理的黃芪莖葉相比(另文發(fā)表)，經(jīng)過超聲處理后的黃芪莖葉通過醇提，其總黃酮的含量上升一倍左右，因此在實際生產(chǎn)中應(yīng)當(dāng)重視超聲處理的作用。本研究所得的實驗?zāi)Ｐ途哂休^好的預(yù)測性，實驗重復(fù)性好，可為黃芪莖葉總黃酮的工業(yè)化提取提供一定的理論支持。

NO是一種常見的炎性介質(zhì)，過量的NO可導(dǎo)致一系列炎癥疾病的發(fā)生[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度范圍內(nèi)的黃芪莖葉總黃酮(1～50 μg·mL-1)對RAW264.7細胞無明顯毒性，除能夠減少RAW264.7細胞本底NO的生成外，還可有效抑制由LPS所誘導(dǎo)的NO濃度急劇上升，由此說明，黃芪莖葉總黃酮具有一定的抗炎活性。