胡珂，何忠臻，彭華勝，詹志來(lái)

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 安徽省道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700)

常用中藥延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang為多年生植物，以干燥塊莖入藥，有活血、止痛作用[1]。延胡索最早記載于唐代陳藏器的《本草拾遺》，是著名的浙八味之一[2]。根據(jù)前期調(diào)查，目前市場(chǎng)上延胡索商品都以粒徑大小進(jìn)行等級(jí)劃分，而且在全國(guó)最大產(chǎn)區(qū)的陜西，產(chǎn)地加工方法簡(jiǎn)陋，易造成塊莖頹廢組織大量脫落，這些狀況都會(huì)對(duì)正確評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量產(chǎn)生不利的影響。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相法分別測(cè)定延胡索塊莖的頹廢組織、表皮、韌皮部等不同部位中延胡索乙素的含量，結(jié)合前期市場(chǎng)調(diào)查及產(chǎn)地現(xiàn)狀對(duì)其品質(zhì)進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，以期為今后延胡索產(chǎn)地加工方法的改進(jìn)及商品規(guī)格等級(jí)的制定起到參考作用。

1 材料與儀器

1.1 材料

分別于2016年11～12月延胡索休眠期采集安徽省合肥市大蜀山的野生塊莖，由安徽亳州康美中藥材市場(chǎng)、河北安國(guó)東方藥城、四川荷花池中藥材專業(yè)市場(chǎng)、廣西玉林市中藥材專業(yè)市場(chǎng)購(gòu)得栽培延胡索藥材商品，經(jīng)胡珂教授鑒定為罌粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的塊莖。

1.2 儀器

Milli-Q Advantage A10一體式超純水機(jī)(美國(guó)Milipore公司)；移液槍；FA2014B電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；Agilent 1260型自動(dòng)進(jìn)樣高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫有限公司(Santa Clara，CA，USA)；色譜柱Agilent 5 TC-C 18(2)250×4.6 mm；WL-100型打粉機(jī)(威力制藥機(jī)械廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，超聲機(jī)、烘箱。

1.3 試劑

超純水(電阻率大于18.2 M·Ωcm-1)；甲醇(色譜純)；濃氨(分析純)；延胡索乙素(HPLC>98%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品前處理

采挖合肥大蜀山自然休眠5個(gè)月的野生延胡索塊莖(此時(shí)頹廢組織已形成)，洗凈后于烘箱中60 ℃恒溫烘6 h，陰干保存一天左右。用刀片剝離出頹廢組織、表皮、韌皮部、木質(zhì)部及髓，分離后繼續(xù)陰干，至完全干燥后分部位用搗藥罐搗碎，過(guò)藥典3號(hào)篩。

2.2 色譜條件

色譜柱Agilent 5 LC-TC18(2)250×4.6 mm；流動(dòng)相為甲醇-水(69：31)，等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量5 μL，柱溫28 ℃。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取延胡索乙素對(duì)照品0.53 mg置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度線定容，用移液槍精密移取1 mL母液和4 mL甲醇，混合配成1 mL含4.24 μg延胡索乙素的對(duì)照品貯備溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取各組樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5 g，置錐形瓶中，加入現(xiàn)配好的濃氨試液-甲醇(1∶20)混合溶液50 mL，冷浸30 min后，超聲30 min。搖勻，抽濾。續(xù)濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，殘?jiān)蛹状?色譜純)溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并用甲醇(色譜純)稀釋至刻度，搖勻。用5 mL一次性注射器吸取約1.5 mL樣品，溶液用0.22 μm過(guò)濾針頭濾過(guò)，取續(xù)濾液于2 mL的干燥潔凈的進(jìn)樣瓶中，編號(hào)即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取延胡索乙素對(duì)照品溶液5、7、10、15、17、20 μL在上述色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得峰面積值，以峰面積值和進(jìn)樣量進(jìn)行回歸處理，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品的進(jìn)樣量(X，μL)為橫坐標(biāo)，縱到標(biāo)準(zhǔn)為曲線得回歸方程Y=3.209X+0.136 1，r=0.999 9，呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 延胡索乙素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取延胡索乙素對(duì)照品溶液10 μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面面積值，延胡索乙素的峰面積的RSD(n=6)=0.887 9%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 延胡索標(biāo)準(zhǔn)品精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表(n=6)

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取延胡索同一份供試品溶液，按照2.3條件下的方法進(jìn)行提取，采用上述2.2色譜條件，在9、12、15、18、21、24、3、6 h進(jìn)樣5 μL測(cè)定，延胡索乙素的峰面積的RSD(n=8)=0.715 6%，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批延胡索藥材樣品5份，按2.3條件下的方法進(jìn)行提取，依照2.2色譜條件進(jìn)樣5 μL，其延胡索乙素的峰面積的RSD(n=5)=1.652 1%，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 延胡索樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表(n=8)

表3 延胡索樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表(n=5)

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取同批延胡索藥材粉末6份0.5 g，精密稱定，按照上述提取方法及色譜條件進(jìn)行延胡索乙素含量測(cè)定，另外加標(biāo)準(zhǔn)品0.20 mg，測(cè)得其延胡索乙素總含量，平均回收率為96.91%，RSD(n=6)=1.561%，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 延胡索樣品加樣回收結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

2.9 樣品含量測(cè)定

2.9.1 11月份延胡索塊莖不同部位延胡索乙素測(cè)定

11月份采挖合肥大蜀山野生延胡索洗凈后于烘箱中60 ℃恒溫烘6 h，陰干保存1d左右。用刀片將延胡索剝離為3部分：頹廢組織及表皮、韌皮部、木質(zhì)部及髓，分離后繼續(xù)陰干。至完全干燥后分部位用搗藥罐搗碎，過(guò)藥典3號(hào)篩。按照2.3條件下對(duì)剝離的不同部位進(jìn)行提取，在2.2色譜條件下進(jìn)樣。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 11月份延胡索不同部位延胡索乙素含量測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

2.9.2 12月份不同塊莖延胡索乙素測(cè)定

根據(jù)11月份測(cè)定結(jié)果，于12月份采挖合肥大蜀山野生延胡索洗凈后于烘箱中60 ℃恒溫烘6 h，陰干保存一天左右。手工剝離延胡索的頹廢組織及表皮兩部分。烘干至完全干燥后分部位用搗藥罐搗碎，過(guò)藥典3號(hào)篩。按照2.3條件下對(duì)剝離的不同部位進(jìn)行提取，在2.2色譜條件下進(jìn)樣。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 12月份延胡索不同部位延胡索乙素含量測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

2.9.3 不同產(chǎn)地規(guī)格樣品中延胡索乙素測(cè)定

抽取市場(chǎng)中部分商戶的樣品，兩兩一組進(jìn)行對(duì)照，將同一商戶的貨源地視為相同，測(cè)定各樣品中的延胡索乙素含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 不同產(chǎn)地規(guī)格樣品延胡索乙素液相結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

3 討論

3.1 延胡索塊莖中延胡索乙素的分布

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在延胡索塊莖中的各個(gè)部位均含有延胡索乙素，在相同質(zhì)量的前提下，木質(zhì)部及髓中含量最高，頹廢組織及表皮中次之，而占延胡索塊莖主要體積的韌皮部中含量最少，其中頹廢組織較表皮又略高一些。合肥大蜀山的野生品延胡索乙素含量普遍高于各產(chǎn)地不同等級(jí)的栽培品(商品延胡索)，而在這些不同規(guī)格等級(jí)的商品延胡索中，延胡索乙素的含量與等級(jí)沒(méi)有必然的相關(guān)性，因此也可說(shuō)明延胡索乙素在延胡索塊莖各部位均有分布，非在等級(jí)高的選貨(體積大)，即韌皮部多的塊莖中分布多。

3.2 根據(jù)產(chǎn)地現(xiàn)狀對(duì)延胡索加工方式的建議

目前浙江與陜西為延胡索兩大主產(chǎn)區(qū)，其中陜西產(chǎn)量最大，但陜西產(chǎn)區(qū)由于條件限制，對(duì)延胡索的初加工方法簡(jiǎn)陋，多以簡(jiǎn)易大鍋水煮，煮后自然曬干的方式。在水煮過(guò)程中皮殼(即頹廢組織及表皮)大量脫落，脫落的皮殼均用風(fēng)機(jī)吹去。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，延胡索頹廢組織及表皮中尚含有大量的延胡索乙素，此種加工方式可造成入藥部分的大量浪費(fèi)，且有文獻(xiàn)報(bào)道水煮方法雖利于大規(guī)模生產(chǎn)，但會(huì)造成延胡索乙素的大量流失[3]。因此建議陜西產(chǎn)區(qū)應(yīng)設(shè)立統(tǒng)一加工點(diǎn)，采用浙江產(chǎn)區(qū)直接烘干的方式，以達(dá)到提升藥材質(zhì)量的目的。

3.3 對(duì)延胡索商品規(guī)格劃分的建議

目前市場(chǎng)中延胡索藥材規(guī)格等級(jí)主要分為統(tǒng)貨與選貨，以過(guò)篩的方式進(jìn)行劃分，二者的價(jià)格在市場(chǎng)上也有區(qū)別。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，如以有效成分延胡索乙素的含量來(lái)衡量藥材質(zhì)量并按質(zhì)論價(jià)，此種劃分方法缺乏一定的合理性。曾有研究表明，剝離切塊的延胡索中生物堿與粒徑大小成負(fù)相關(guān)[4]；也有文獻(xiàn)闡明，在粒徑大小10～20 mm的延胡索塊莖中，延胡索乙素含量無(wú)顯著性差異[5]，其結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)市場(chǎng)樣品的測(cè)定結(jié)果相同，因此延胡索等級(jí)劃分方式及劃分依據(jù)有待商榷。

4 結(jié)論

延胡索塊莖的頹廢組織中延胡索乙素含量較高，因此采收加工中脫落的皮殼仍有很高的藥用價(jià)值，對(duì)于這一資源應(yīng)當(dāng)合理利用。野生延胡索資源雖有分布，但由于自然生長(zhǎng)環(huán)境的限制，人工采挖效率低下，沒(méi)有產(chǎn)量，因此栽培延胡索仍然是商品的主要來(lái)源。據(jù)調(diào)查，當(dāng)前國(guó)內(nèi)栽培延胡索多由浙江引種，陜西已成為最大產(chǎn)區(qū)，但現(xiàn)有的產(chǎn)地加工方式會(huì)造成原藥材質(zhì)量下降，應(yīng)借鑒浙江產(chǎn)地加工模式進(jìn)行改良。1984年由原國(guó)家醫(yī)藥管理局和衛(wèi)生部聯(lián)合發(fā)布的《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》，規(guī)定延胡索規(guī)格等級(jí)為一等：每50克45粒以內(nèi)；二等：每50克45粒以外[6]。目前市場(chǎng)上商品延胡索仍按照此標(biāo)準(zhǔn)，以粒徑大小作為等級(jí)劃分及確定價(jià)格的主要依據(jù)，這一劃分方式需要進(jìn)一步修正。