楊振，何麗明，倪賽宏，傅水蓮，鄒麗園，洪鐵*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012；3.吉林大學(xué) 藥學(xué)院 藥理教研室，吉林 長(zhǎng)春 031021，4.吉林大學(xué) 中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130033)

我國(guó)心腦血管疾病發(fā)病率逐年升高且日益年輕化。目前，心腦血管疾病已成為危害人群健康最嚴(yán)重的疾病[1]。流行病學(xué)研究顯示，我國(guó)約有2.9億人患心血管疾病，每小時(shí)約300人死于心腦血管疾病。高脂血癥作為心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一，其在動(dòng)脈粥樣硬化和腦血管病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。預(yù)防和治療高脂血癥是防治心腦血管疾病的重要途徑[2]。目前，臨床上使用的降血脂藥物包括：用于促進(jìn)膽酸或膽固醇排泄、促進(jìn)膽固醇的降解、抑制膽酸和膽固醇吸收的膽酸螯合劑，如考來(lái)替泊、考來(lái)烯胺等；抑制膽固醇合成關(guān)鍵酶羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的HMG-CoA還原酶抑制劑類，如洛伐他汀、普伐他汀等；抑制cAMP的形成、導(dǎo)致甘油三酯酶活性降低、進(jìn)而降低血液中甘油三酯濃度的煙酸及其衍生物，如阿西莫司、煙酸肌醇酯等。上述藥物雖能夠達(dá)到降血脂的作用，但長(zhǎng)期服用均出現(xiàn)較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此，尋求療效顯著、安全可靠的調(diào)血脂的藥物得到廣泛關(guān)注[3-5]。

旋覆花是一種傳統(tǒng)的中草藥，為菊科旋覆花屬植物歐亞旋覆花的干燥頭狀花絮，主要分布于中國(guó)、韓國(guó)和日本，中國(guó)主要產(chǎn)于河南、河北、江蘇、浙江、新疆、東北等地[6]。該藥收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部，味咸、性溫，入肺、腎經(jīng)，主治咳嗽消炎等。目前，已報(bào)道的旋覆花的化學(xué)成分約有40多種，主要含有甾醇、倍半萜、香豆素及黃酮類化合物，具有抗炎、抗肝損傷、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性。本研究采用高糖高脂飲食建立高脂血癥SD大鼠模型，初步探討旋覆花總黃酮對(duì)高脂血癥大鼠的降脂及改善脂肪肝作用[7-8]。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SD大鼠，雄性，150～160 g，SPF級(jí)，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物制品有限公司，許可證號(hào)：SCXK(遼)-2015-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院的SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)，室內(nèi)溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，晝夜明暗交替時(shí)間12/12 h，大鼠自由進(jìn)食飲水。

1.2 試劑和藥品

旋覆花采自吉林省長(zhǎng)春市雙陽(yáng)區(qū)，標(biāo)本存放于吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院長(zhǎng)白山資源所(編號(hào)：201700902)，經(jīng)吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院牛志多研究員鑒定為歐亞旋覆花InulabritannicaThunb.。

總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三脂(TG)試劑盒、總膽汁酸(TBA)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；血清白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；蘇木紫(Britain進(jìn)口分裝)；曙紅(水溶，天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

2 方法

2.1 旋覆花總黃酮的制備

取一定量旋覆花浸泡3 h后，過(guò)濾，濾渣用乙醇回流提取2次后過(guò)濾，合并濾液，濃縮。減壓干燥以獲得黃酮粗提取物。AB-8大孔樹(shù)脂純化歐亞旋覆花總黃酮的工藝條件為：提取物上樣濃度為0.2 g·mL-1，以2 mL·min-1的流速緩慢上樣，用70%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫速度為3 mL·min-1，以高效液相法測(cè)定黃酮的含量，純化后總黃酮純度為86.54%。

2.2 動(dòng)物分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將其隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組，辛伐他丁陽(yáng)性藥組(3.33 mg·kg-1)，旋覆花總黃酮高劑量組(100 mg·kg-1)、中劑量組(50 mg·kg-1)、低劑量組(25 mg·kg-1)，除空白組飼喂基礎(chǔ)飼料外，其余各組大鼠喂食高脂飼料(63.6%維持飼料、20%蔗糖、15%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉)建造高血脂癥模型，連續(xù)造模4周。第五周開(kāi)始，繼續(xù)給予高糖高脂飼料的同時(shí)給予相應(yīng)劑量的受試物干預(yù)，持續(xù)8周，每周測(cè)定1次體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量，每日早9時(shí)每籠(5只)給予400 g飼料，次日早9時(shí)收集飼料，稱體質(zhì)量，計(jì)算每只大鼠的日均攝食量。

2.3 血清指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，禁食12 h后，腹腔注射10%水合氯醛使大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30 min后，300×g，4 ℃，離心10 min，收集上清液，-80 ℃保存。按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、SOD、MDA、GSH-PX、TNF-α、IL-6、IL-10水平。

2.4 肝臟指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速解剖大鼠，精確稱取大鼠相同部位肝臟0.2 g，在冰水中制成10%勻漿，4 ℃ 4000 r·min-1離心10 min，提取上清液，測(cè)定其中總膽固醇水平。取0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm塊狀的肝臟組織用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液沖洗后擦干，快速置于中性福爾馬林溶液中固定。

2.5 糞便膽汁酸

于大鼠處死前12 h將大鼠分籠飼養(yǎng)，12 h后收集大鼠糞便，糞便經(jīng)真空冷凍干燥后，用磷鉬酸比色法測(cè)定糞便中總膽汁酸的含量[9]。

2.6 肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察

固定好的肝臟組織塊，依次用75%、95%和100%乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，H&E染色，于光學(xué)顯微鏡下病理學(xué)觀察每組切片中肝臟的脂肪變性、炎癥細(xì)胞及組織壞死程度。按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：+表示肝小葉結(jié)構(gòu)尚存，肝組織結(jié)構(gòu)大致正常，匯管區(qū)周?chē)渭?xì)胞腫脹、輕度脂肪變性；++表示肝細(xì)胞排列紊亂，大部分肝細(xì)胞腫脹、氣球樣變，匯管區(qū)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；+++表示肝小葉結(jié)構(gòu)輪廓消失，肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，可見(jiàn)部分肝細(xì)胞脂肪變性，也可見(jiàn)部分動(dòng)物出現(xiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀或片狀壞死，匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.7 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 對(duì)大鼠體質(zhì)量及食量的影響

表1結(jié)果顯示，各劑量組大鼠進(jìn)食量未存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與對(duì)照組相比，高脂血癥模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率顯著增加(P<0.05)，連續(xù)給予旋覆花總黃酮4周能夠顯著降低高脂血癥模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率(P<0.05，P<0.01)。

表1 對(duì)高血脂癥大鼠日均進(jìn)食量及體質(zhì)量增長(zhǎng)率的影響

注：與對(duì)照組相比，##P<0.05；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。

3.2 對(duì)高血脂癥大鼠血脂水平的影響

表2結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高脂血癥模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著增加，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)，連續(xù)給予旋覆花總黃酮4周能夠顯著降低高脂血癥模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平(P<0.05，P<0.01)。

3.3 對(duì)高血脂癥大鼠肝臟中膽固醇與糞便中膽汁酸水平的影響

表3結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高脂血癥模型組大鼠肝臟中膽固醇水平顯著增加(P<0.05)，連續(xù)給予旋覆花總黃酮4周能夠顯著降低高脂血癥模型組大鼠肝臟中膽固醇水平(P<0.01)；與對(duì)照組相比，高脂血癥模型組大鼠糞便膽汁酸水平顯著增加(P<0.05)，連續(xù)給予旋覆花總黃酮4周能夠顯著增加高脂血癥模型組大鼠糞便中膽汁酸水平(P<0.05，P<0.01)。

3.4 對(duì)高血脂癥大鼠肝臟病理形態(tài)的影響

形態(tài)評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表4，光鏡下H&E染色顯示，普通飲食組大鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉規(guī)則，細(xì)胞中央有大而圓的核，細(xì)胞質(zhì)均勻(見(jiàn)圖1A)。高脂飲食組大鼠肝細(xì)胞腫脹，體積較正常明顯增大，出現(xiàn)脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大小不等的脂滴空泡，以大泡性脂肪滴為主，匯管區(qū)有以單核、淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死和灶狀壞死，大鼠出現(xiàn)散在性肝細(xì)胞脂肪變性(見(jiàn)圖1B)。給予旋覆花高、中、低劑量及辛伐他丁可改善肝臟的相關(guān)病理改變(見(jiàn)圖1C、D、E、F)。

3.5 對(duì)高血脂癥大鼠血清抗氧化活性的影響

表5結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高脂血癥模型組大鼠血清中SOD活性顯著降低、MDA水平及GSH-PX活性顯著升高(P<0.05)；連續(xù)給予旋覆花總黃酮4周能夠顯著升高高脂血癥模型組大鼠血清中SOD活性，降低MDA水平及GSH-PX活性(P<0.05，P<0.01)。

3.6 對(duì)高血脂癥大鼠血清炎癥因子的影響

表6結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高脂血癥模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平顯著升高，IL-10水平顯著降低(P<0.05)；連續(xù)給予旋覆花總黃酮4周能夠顯著降低高脂血癥模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平，升高IL-10水平(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。

表2 對(duì)高脂血癥模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的影響 mmol·L-1

表3 對(duì)高脂血癥大鼠肝臟中膽固醇及糞便中膽汁酸水平的影響

表4 對(duì)模型組大鼠肝臟病理形態(tài)的影響

注：A.普通飲食組；B.高脂飲食組；C.高脂飲食+辛伐他丁組；D.高脂飲食+旋覆花低劑量組；E.高脂飲食+旋覆花中劑量組；F.高脂飲食+旋覆花高劑量組。圖1 各組大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果(HE×200)

表5 對(duì)高脂血癥模型組大鼠血清中SOD、MDA、GSH-PX水平的影響

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

表6 對(duì)高脂血癥模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10水平的影響

4 討論與結(jié)論

高脂血癥作為由機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂引發(fā)的血漿中脂質(zhì)濃度升高的疾病，其臨床表現(xiàn)為體質(zhì)量增加，血清TC、TG以及LDL-C水平過(guò)高，HDL-C水平過(guò)低[10]。本研究表明，經(jīng)口給予旋覆花總黃酮能夠在不影響大鼠進(jìn)食量的情況下抑制體質(zhì)量增加，同時(shí)降低高血脂癥模型大鼠肝臟中膽固醇水平、糞便中膽汁酸水平、血清中TC、TG及LDL-C水平，提高HDL-C水平，具有改善高脂血癥臨床癥狀。

膽固醇在肝中不斷代謝為膽汁酸，其隨膽汁排入腸腔，參與脂肪的消化與吸收。隨后約95%膽汁酸再經(jīng)小腸被重吸收，形成“肝腸循環(huán)”而重復(fù)利用。本研究結(jié)果顯示，旋覆花總黃酮能夠促進(jìn)膽汁酸排泄，進(jìn)而阻止機(jī)體對(duì)于膽汁酸的吸收，以抑制肝腸循環(huán)，進(jìn)而達(dá)到降低肝臟中膽固醇的效果。

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)探究了旋覆花總黃酮對(duì)高血脂癥大鼠血清相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示，高血脂癥大鼠血清中脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)總產(chǎn)物MDA水平增加，而抗氧化酶GSH-PX和SOD活性極顯著下降，表明高脂血癥大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化水平增加和自由基清除能力下降。經(jīng)口給予旋覆花總黃酮后，大鼠血清中的GSH-PX和SOD活性均顯著提高，MDA含量顯著降低，即旋覆花總黃酮可能通過(guò)提高機(jī)體抗氧化活性，降低體內(nèi)自由基的水平，改善高脂血癥大鼠體內(nèi)氧化-抗氧化失衡狀態(tài)。

在高血壓、高血脂癥、動(dòng)脈粥樣硬化患者血漿中，炎癥因子水平發(fā)生明顯變化，其由脂肪組織分泌產(chǎn)生，參與炎癥反應(yīng)，且在脂肪分解代謝中發(fā)揮作用。促炎及抗炎因子的失衡可導(dǎo)致脂肪肝，研究顯示，高血脂癥大鼠的血清中TNF-α、IL-6水平顯著升高，IL-10水平顯著降低，經(jīng)口給予旋覆花總黃酮后，大鼠血清中TNF-α、IL-6水平顯著降低，IL-10水平顯著升高，其能夠緩解高脂血癥低度炎癥狀態(tài)。

有大量的研究報(bào)道，中藥黃酮類具有改善脂肪肝的作用，如山楂總黃酮、甘草總黃酮、大豆異黃酮等[11-14]。但其改善脂肪肝的機(jī)制也存在著不同，如山楂總黃酮、大豆異黃酮主要作用機(jī)制是抗氧化作用[11-12]，甘草總黃酮是通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)分子改善脂肪肝[13]。而本研究表明旋覆花總黃酮的作用機(jī)制是多方面的，除抗氧化作用外，具有促進(jìn)膽汁酸排泄及抑制炎癥的作用，進(jìn)而發(fā)揮降血脂及改善脂肪肝的作用，這也為旋覆花治療脂肪肝奠定了理論基礎(chǔ)。