鄒奕 ，興旺 ，2，3，朱尚明 ，栗媛 ，齊少瑋 ，吳則東 ，2，3*

（1.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學院甜菜研究所/黑龍江大學農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱150080）

甜菜基因組DNA提取的方法很多，如常用的CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法就是利用CTAB將細胞膜溶解，并與核酸形成復合物，此復合物在高鹽濃度下溶解于液相中，而在低鹽的溶液中則會沉淀，CTAB緩沖液中含有高濃度的NaCl，用于提供高鹽濃度，同時含有EDTA，用于抑制DNase活性，使用酚、氯仿和異戊醇對蛋白質進行變性抽提，最后用乙醇或者異丙醇對DNA進行沉淀；其它的提取方法還有SDS（十二烷基磺酸鈉）法、蛋白酶K法、使用試劑盒以及堿裂解法等等。如臘萍等[1]分別采用CTAB法和SDS法提取甜菜基因組DNA，結果表明，改進的CTAB法提取的DNA純度好，產(chǎn)率高；沙紅等[2]也對CTAB法和SDS法提取甜菜基因組DNA進行比對，結果也表明CTAB法提取的DNA純度要好于SDS法；吳則東等[3]利用堿裂解法提取甜菜基因組DNA，該方法提取DNA只需要一種藥劑，提取方便且時間短，提取的DNA可以用于SSR引物擴增，但由于沒有經(jīng)過提純，故雜質較高。在甜菜基因組DNA的提取過程中，取樣一般以葉片[4]、花蕾[5]、種子[6]、幼嫩花序及塊根[7]為材料進行基因組DNA的提取。

決定DNA的效率以及純度很重要的一個因素是關于樣品的處理，利用鮮樣提取DNA，要想保證提取DNA的純度，就一定要避免樣品的降解，以往在處理樣品時，大都利用液氮在研缽中進行研磨或者利用研磨杵在離心管中將樣品研磨成粉末，研缽研磨樣品后在轉移到離心管中時容易造成樣品損失，而且一般都是鮮樣直接處理，而研磨杵在研磨時由于操作的角度較小，容易造成部分樣品無法研磨成粉末。本文將探討如何通過處理樣品較快速地提取甜菜基因組DNA，并驗證提取的DNA濃度及純度。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

實驗中用到的12個甜菜品系均來自于中國農(nóng)業(yè)科學院甜菜研究所，樣品編號分別為1～12。

每份甜菜種子取10粒，用紗布包好后放到蒸餾水中浸泡24h，將蛭石放到搪瓷盤里，用自來水浸泡后，將水空出，然后放到烘箱中進行烘干，180℃，大約4h，待蛭石烘干后，取出，溫度降到室溫后，將蛭石裝入到營養(yǎng)缽中，留3cm左右的高度，營養(yǎng)缽中加蒸餾水至水從營養(yǎng)缽下面剛好流出，每個營養(yǎng)缽播種10粒浸泡好的種子，上面覆蓋好消毒的蛭石。待兩片子葉展平后，每份種子取5株用于提取基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 甜菜DNA提取方法 處理1：取1～6號編號的樣品，每個樣品取3株，用錫箔紙包好，然后將包好樣品的錫箔紙放入到預先裝好液氮的小罐中，等到液氮不再發(fā)出吱吱聲時，用鑷子夾出錫箔紙，然后用研磨棒快速研磨錫箔紙，將樣品研磨成粉末，倒入2mL的離心管中，然后向離心管中加入800μL的CTAB緩沖液，65℃干浴1h，期間上下?lián)u動幾次，使CTAB充分浸入到樣品中去；將樣品冷卻至室溫，加入400μL的24∶1的氯仿/異戊醇，上下混勻；12000 r/min離心10min，取上清液加入到2mL的離心管中，然后加入等體積的異丙醇，上下?lián)u動后放入到冰箱冷凍層10min，之后12000 r/min離心10min，棄掉上清液；利用干浴鍋將異丙醇揮發(fā)干凈，加入100μL的TE溶解DNA。

處理2：取7～12號編號的樣品，每個樣品取3株放入到預裝有800μL CTAB緩沖液的2mL離心管中，每個離心管中放入兩粒鋼珠，直接利用研磨機進行打磨，反復震蕩幾次，待樣品打碎后，將鋼珠倒出，把離心管放入到干浴鍋中，之后步驟同處理1。

1.2.2 甜菜基因組DNA的檢測 分別利用微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度。微量分光光度計檢測時只需要滴入2μL的DNA原液進行檢測，瓊脂糖檢測時加入5μL的DNA原液和1μL的6×染料，利用凝膠成像系統(tǒng)進行照相記錄。1.2.3 SSR檢測 將提取的DNA均稀釋到10ng/μL，利用SSR引物分別進行擴增，體系和程序見文獻[8]，PCR產(chǎn)物的檢測利用快速銀染法[9]。

2 結果與分析

表1 樣品不同處理方法提取的DNA濃度

2.1 利用微量分光光度計檢測

利用微量分光光度計對提取DNA的濃度和純度進行檢測（表1），兩種處理方法提取的DNA濃度相差不大，說明兩種處理樣品的方法均能夠提取出濃度較高的DNA。

2.2 瓊脂糖檢測提取DNA的純度

利用1%的瓊脂糖凝膠對提取的DNA進行檢測，檢測結果見圖1，編號1～6對應處理1，編號7～12對應處理2，從圖1中可以看出，處理1條帶清晰完整，沒有虛帶，說明提取的DNA純度非常好，而處理2均有部分虛帶，可能是由于震蕩過程中造成個別DNA條帶斷裂所致。

2.3 利用PCR對提取的甜菜基因組DNA進行擴增

利用甜菜SSR引物FDSB1023對12個品系進行擴增，擴增后的產(chǎn)物利用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行檢測，從圖2擴增結果可以看出，兩種處理樣品的方法均能對SSR引物進行擴增。說明兩種提取方法均可用于甜菜SSR引物的擴增。

圖1 1%瓊脂糖凝膠對甜菜品系提取的DNA檢測結果1～12甜菜品系編號

圖2 引物FDSB1023對甜菜品系的聚丙烯酰胺檢測結果1～12為甜菜品系編號

3 結論

影響基因組DNA提取效率和效果的一個主要因素就是對樣品的處理，樣品研磨的越精細，提取DNA的效果越好，同時對于冷凍的樣品又害怕反復的凍融，這樣DNA就很容易降解。本文給出了一個比較好的解決方案，如果實驗室有研磨機，就可以將要提取DNA的鮮樣直接放到2mL的離心管中，同時在離心管中放入兩顆鋼珠或者鋯珠，如果馬上就提取DNA，可以在離心管中直接加入CTAB緩沖液，之后利用研磨機直接將樣品打碎，進行提取，如果需要以后再進行提取，就可以將加有鋼珠和樣品的離心管放到-80℃的冰箱中進行保存，等到需要提取時再加入緩沖液進行打磨提取，這種提取方法一次就可以處理24個樣品，處理的速度很快；對于沒有研磨機的實驗室，可以在取樣的時候直接利用錫箔紙將植物鮮樣包好，用記號筆記上編號，如果不是近期進行DNA的提取，就把樣品放到-80℃的冰箱中進行保存，在需要提取時，取出直接放到裝有液氮的保溫瓶中冷凍，之后利用研磨棒進行研磨，提取DNA。