蘇東風(fēng)， 李巖松， 潘浩圃

解放軍第四六三醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110042

腦梗死在臨床被稱為缺血性腦卒中，其發(fā)病機(jī)制為腦部血液供應(yīng)中斷，導(dǎo)致局部腦組織的缺血、缺氧，引起局部腦組織發(fā)生缺血性壞死[1-2]。在臨床上由于腦梗死的危害巨大，腦組織缺血壞死區(qū)域多引起患者定位功能障礙，給患者及其家庭帶來經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)及精神上的傷害。目前，有研究報道，腦血管內(nèi)膜的增厚及相應(yīng)的腦血管動脈粥樣硬化性疾病是導(dǎo)致腦梗死發(fā)生的重要原因，腦血管粥樣硬化反應(yīng)是一種炎性因子引起的免疫炎性反應(yīng)，由于炎性因子的激活，導(dǎo)致腦血管動脈粥樣硬化反應(yīng)的加劇[3-6]。CX3CL1是趨化性細(xì)胞因子超家族的重要成員，目前有研究發(fā)現(xiàn)，其在腦血管動脈粥樣硬化的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[7-8]。CX3CL1與CX3CR1受體結(jié)合引起炎性細(xì)胞(如單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)在腦血管壁聚集，并釋放炎癥因子，導(dǎo)致腦血管的狹窄，進(jìn)而引發(fā)腦梗死[9]。隨著人類基因組計劃順利實施，大規(guī)模的腦梗死易感基因的篩查成為研究的熱點[4-6]。本研究旨在探討CX3CL1基因rs170364位點與腦梗死發(fā)生的相關(guān)關(guān)系，進(jìn)而為腦梗死早期預(yù)防提供新的分子生物學(xué)靶標(biāo)?，F(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2015年12月至2017年12月在解放軍463醫(yī)院進(jìn)行入院診治的腦梗死患者430例為觀察組，收集同期在本院健康體檢中心進(jìn)行體檢的健康人員410名為對照組。本研究入選的研究對象均為中國北方漢族人群。腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者須經(jīng)顱腦CT或腦MRI檢查有明確證據(jù)證實為腦梗死；發(fā)病時間≤72 h。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有腎、肝、甲狀腺、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病以及腫瘤的患者，或存在炎癥、感染、糖尿病及家族性高脂血癥的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，入選的研究對象均知情并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 基因分型 在空腹?fàn)顟B(tài)下，收集兩組研究對象的外周血5 ml，利用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)進(jìn)行抗凝，-20℃冰箱儲存[10]。利用北京天根生物試劑公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取兩組研究對象的基因組，測定DNA濃度。采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增入觀察組及對照組的基因組DNA，利用Primer 5.0軟件設(shè)計CX3CL1 rs170364引物，上游引物：5′-TATGTTTGTGGTATGTTCTG-3′，下游引物：5′- TGAGGTACAGTGAGATGAAC-3′。將含有CX3CL1 rs170364目的片段在25 μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，包括基因組DNA 0.2 μg，10×PCR緩沖液2.5 μl，dNTP 1.5 μl，上游和下游引物各1.0 μl，rTaq酶3 U，去離子水25.0 μl，PCR擴(kuò)增反應(yīng)在熱循環(huán)儀(美國BIO-RAD公司)上完成。反應(yīng)條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s、54℃ 45 s、55℃ 45 s，35個循環(huán)；72℃ 30 s；72℃最后延伸7 min。將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送到上海生工科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附測定方法檢測血清中白細(xì)胞介素-8的含量 于入院當(dāng)日或次日清晨狀態(tài)下抽取研究對象肘靜脈血5 ml，搖勻后放置，3 000 r/min，離心20 min，將處理好的血漿貯藏于-80℃低溫冰箱保存。按照試劑盒說明書，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以光密度(optical density，OD)值為縱坐標(biāo)，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出兩組研究對象的每個測定樣品的實際OD值，并計算每個待測樣品的濃度[10]。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象一般資料比較 觀察組患者的年齡、吸煙比例、高血壓發(fā)生率、低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、三酰甘油水平均明顯高于對照組，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高密度脂蛋白膽固醇水平顯低于對照組，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組研究對象體質(zhì)量指數(shù)及性別比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象一般資料比較

2.2 兩組研究對象基因分型及等位基因分布頻率比較 CX3CL1基因rs170364單核苷酸多態(tài)的GG型、GT型、TT型3種基因型在觀察組患者中的分布頻率分別為40.5%(174/430)、48.4%(208/430)和11.2%(48/430)，在對照組中的分布頻率分別為50.7%(208/410)、39.8%(163/410)和9.5%(39/410)，組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CX3CL1基因rs170364多態(tài)的G、T等位基因的分布頻率在對照組分別為70.6%(579/820)、29.4%(241/820)，在觀察組分別為64.7%(556/860)、35.3%(304/860)，組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009；OR=0.76，95%可信區(qū)間0.020～0.934)。多元回歸分析在校正年齡、吸煙、高血壓、高脂血癥等腦梗死的危險因素后，CX3CL1基因rs170364單核苷酸多態(tài)T等位基因仍是腦梗死發(fā)病的一個獨立危險因素。

2.3 兩組研究對象CX3CL1 rs170364不同基因型攜帶者血漿CX3CL1水平比較 觀察組患者的血漿中CX3CL1的表達(dá)水平為(2 437.96±579.85)μg/L，明顯高于對照組的(1 962.85±527.98)μg/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。觀察組患者GT+TT基因型攜帶者血漿中CX3CL1表達(dá)水平為(2 530.32±613.13)μg/L，高于對照組GT+TT等位基因攜帶者的(2 130.24 ±534.62)μg/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。觀察組GG等位基因攜帶者血漿中CX3CL1表達(dá)水平為(2 345.67±546.57)μg/L,高于對照組的(1 723.46±521.34)μg/L，但組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

近年來，腦梗死的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢，而且腦梗死的發(fā)病年齡愈來愈年輕化。因而早期診斷、早期預(yù)測、早期治療腦梗死已成為臨床工作中臨床醫(yī)師亟待解決的問題。近年來有研究報道，動脈粥樣硬化是腦血管疾病發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)，動脈管壁的慢性炎癥引起動脈粥樣硬化反應(yīng)加劇，導(dǎo)致腦血管阻塞性反應(yīng)，引起腦梗死的發(fā)生，免疫介導(dǎo)的炎性反應(yīng)是導(dǎo)致腦血管動脈粥樣硬化反應(yīng)加劇的基礎(chǔ)[11-12]。

CX3CL1是趨化因子家族中的重要成員，具有膜結(jié)合和可溶性兩種形式，存在于體液中。CX3CL1趨化因子一方面可以與CX3CR1受體結(jié)合，引起炎性反應(yīng)，具有趨化因子誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的功能，另一方面CX3CL1具有細(xì)胞黏附分子的功能，參與炎癥局部的級聯(lián)放大反應(yīng)，CX3CL1的雙重作用使之成為重要的炎性趨化因子[13]。趨化因子CX3CL1通過招募血液中炎性反應(yīng)細(xì)胞如單核細(xì)胞和T細(xì)胞到動脈粥樣硬化血管壁，引起管腔局部的炎性級聯(lián)放大效應(yīng)，血管壁局部炎性反應(yīng)加劇，引起粥樣硬化斑塊的進(jìn)展并突出管腔，引起局部血流緩慢，管腔狹窄甚至腦梗死[14]。

隨著人類基因組計劃的順利實施，人類的遺傳學(xué)信息被更多認(rèn)識和利用，由于功能基因靶序列的改變進(jìn)而引起蛋白表達(dá)水平的改變，導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)功能的改變。通常認(rèn)為基因的啟動子區(qū)、外顯子區(qū)、5′非翻譯區(qū)及3′非翻譯區(qū)編碼基因的改變影響蛋白表達(dá)水平的改變。近年來，越來越多的研究證實基因內(nèi)含子區(qū)域多態(tài)的改變也同樣影響基因功能的改變，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平的異常，影響了疾病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程[15]。

rs170364多態(tài)位于CX3CL1基因的內(nèi)含子區(qū)，本研究發(fā)現(xiàn)，在中國漢族人群中CX3CL1 基因rs170364單核苷酸多態(tài)與腦梗死發(fā)生存在相關(guān)關(guān)系，觀察組患者T基因型攜帶者血漿中CX3CL1表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。CX3CL1基因rs170364單核苷酸多態(tài)改變雖然位于基因的非編碼區(qū)域，但其多態(tài)改變影響CX3CL1內(nèi)含子的剪接功能，故影響CX3CL3蛋白的表達(dá)[16-17]，影響動脈血管壁的炎性反應(yīng)過程。

本研究為單中心研究結(jié)果，且收集樣本量相對較少，希望能擴(kuò)大樣本并進(jìn)行多中心的研究來驗證本研究的結(jié)果。同時，本研究入選的研究人群為中國北方漢族人群，需要在不同民族的人群中驗證上述研究結(jié)果。

綜上所述，CX3CL1在觀察組患者的血清中表達(dá)水平明顯高于對照組。CX3CL1 rs170364 T等位基因可能是腦梗死發(fā)病的危險因素，可以預(yù)測腦梗死的發(fā)生，為腦梗死的臨床預(yù)防研究提供分子遺傳學(xué)的靶標(biāo)。