鞏五虎，薛少華，張 巖，林 源

（1.西安市公安局刑事偵查局技術(shù)處，陜西 西安 710038；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海200063）

1 案例

1.1 簡(jiǎn)要案情

兩名女性（全文用A和B進(jìn)行標(biāo)示）要求進(jìn)行同父姐妹親緣關(guān)系鑒定，父母均已過(guò)世，且無(wú)任何其他直系親屬，無(wú)任何身份證明文件，如出生記錄、戶口記錄等。

常規(guī)檢測(cè)手段為采用X-STR檢測(cè)試劑盒對(duì)上述兩名個(gè)體DNA樣本進(jìn)行分型檢測(cè)。采用商業(yè)化檢測(cè)試劑盒Investigator X-12試劑盒（德國(guó)凱杰公司）對(duì)12個(gè)X-STR基因座進(jìn)行分型檢測(cè)[1]。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因座DXS8378和HPRTB存在突變的可能性，分型信息見表1。由于基因座DXS8378和HPRTB分別為X染色上連鎖群1和連鎖群4的核心基因座，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上推出的Goldeneye 17X試劑盒（北京基點(diǎn)認(rèn)知生物有限公司）含有上述兩個(gè)基因座。兩個(gè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果表明，相同基因座檢測(cè)結(jié)果一致，新增加的X-STR基因座分型在A和B個(gè)體中均檢見一個(gè)相同的等位基因。該案例依據(jù)現(xiàn)有檢測(cè)手段，無(wú)法做出肯定性的判斷結(jié)果。

表1 兩名女性個(gè)體（A和B）在12個(gè)X-STR基因座的分型結(jié)果

1.2 X-InDel位點(diǎn)的檢測(cè)信息

采用含有18個(gè)X染色體上Indel（Insertion-Deletion，Indel）位點(diǎn)的復(fù)合擴(kuò)增體系對(duì)上述兩份DNA樣本進(jìn)行分型檢測(cè)[2]。該復(fù)合擴(kuò)增體系及應(yīng)用已獲專利授權(quán)（ZL 2013 1 0161815.3）。PCR反應(yīng)采用10μL擴(kuò)增體系，其中，包括PCR反應(yīng)緩沖液2 μL，引物混合物 1 μL，DNA 聚合酶 1 μL，模板 DNA 0.5 ng，其余體積用去離子水補(bǔ)齊。反應(yīng)體系在9700 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增參數(shù)為：95℃15 min；94℃30 sec、65℃90 sec、72℃、90 sec，共進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；60℃延伸60 min。PCR產(chǎn)物變性后在3130XL遺傳分析儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳，采用已授權(quán)分型文件進(jìn)行等位基因結(jié)果判讀。兩份樣本在18個(gè)X-Indel的分型均檢見一個(gè)相同的等位基因。

1.3 X-SNP位點(diǎn)的檢測(cè)信息

為進(jìn)一步獲取遺傳信息量，以更好地做出結(jié)果判斷，嘗試采用已完成驗(yàn)證的高通量并行測(cè)序（Massive parallel sequencing， MPS）體系對(duì) 29個(gè) XSNP位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)[3]。測(cè)序在Ion Torrent PGM（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）完成，主要步驟包括文庫(kù)構(gòu)建、文庫(kù)修飾及定量、文庫(kù)富集及定量、芯片loading及測(cè)序、數(shù)據(jù)分析。兩份樣本在29個(gè)X-SNP位點(diǎn)分型均檢見一個(gè)相同的等位基因。

1.4 基于MPS技術(shù)對(duì)X-STR測(cè)序檢測(cè)

針對(duì)Investigator X-12試劑盒中包含的12個(gè)X-STR基因座進(jìn)行MPS文庫(kù)構(gòu)建引物設(shè)計(jì)，其中DXS10134、DXS10079和 DXS10148基因座無(wú)法獲取理想的文庫(kù)構(gòu)建引物，其余9個(gè)STR基因座引物信息見表2。測(cè)序在Ion Torrent PGM平臺(tái)進(jìn)行，采用“PGM:Ion PGMTMTemplate OT2 400 Kit for Hi-QTM”模式進(jìn)行400 bp文庫(kù)測(cè)序，芯片為314 V2。測(cè)序發(fā)現(xiàn)樣本A和B在9個(gè)X-STR基因座上檢見的相同等位基因序列結(jié)構(gòu)一致，如DXS10101基因座相同等位基因29.2的序列結(jié)構(gòu)均為[AAAG]3GAAAGAAG[GAAA]3A[GAAA]4AAGA[AAAG]5AAAAAGAA[AAAG]14AA，其中黑色加粗的堿基不納入重復(fù)結(jié)構(gòu)計(jì)算[4]。

2 討論

由于女性個(gè)體含有兩條X染色體，男性個(gè)體只有一條X染色體，故X染色體遺傳標(biāo)記具有伴性遺傳的特征，表現(xiàn)為性連鎖遺傳，以單倍體形式遺傳給子代，即母親可將兩條X染色體上的等位基因隨機(jī)地遺傳給子女，而父親X染色體上的等位基因則只能遺傳給女兒[1-2]。理論上同父姐妹樣本在X染色體上遺傳標(biāo)記必然會(huì)檢見一個(gè)相同的等位基因。本案例特殊之處在于對(duì)X染色體上12個(gè)STR基因座的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，其中兩個(gè)X-STR基因座基因分型均為純合子，存在一步突變的可能性。目前對(duì)于X染色體上遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)檢測(cè)試劑盒僅針對(duì)STR基因座展開，最多可以檢測(cè)17個(gè)X-STR基因座。為確保基因分型不存在等位基因漏檢現(xiàn)象，采用含有上述兩個(gè)基因座的其他生產(chǎn)廠商推出的試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證。另外，對(duì)于X-STR遺傳標(biāo)記的親權(quán)關(guān)系計(jì)算，無(wú)統(tǒng)一的算法及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)遇到類似本案例情況時(shí)，如何進(jìn)一步增加遺傳信息檢測(cè)，獲取更為科學(xué)可靠的法醫(yī)學(xué)證據(jù)，值得進(jìn)一步研究。

表2 9個(gè)X-STR文庫(kù)構(gòu)建引物信息

本案例嘗試采用自行研發(fā)的基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的X-Indel復(fù)合擴(kuò)增體系對(duì)上述突變案例樣本進(jìn)行了X染色體上遺傳信息的補(bǔ)充檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果不排除A與B個(gè)體屬于同父姐妹關(guān)系。Indel遺傳標(biāo)記可分為插入和缺失兩種等位基因形式，本質(zhì)上也屬于SNP位點(diǎn)，但是由于存在長(zhǎng)度差異，可以在法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室必備的遺傳分析儀上完成檢測(cè)，該技術(shù)易于在基層法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室推廣。

另外，本研究采用MPS技術(shù)對(duì)X-SNP位點(diǎn)和X-STR基因座進(jìn)行了測(cè)序檢驗(yàn)。SNP在遺傳分析儀上采用SNPshot技術(shù)也可以完成，但是由于熒光素限制，對(duì)于引物設(shè)計(jì)存在梯度長(zhǎng)度排布的要求，且應(yīng)用于降解檢材效果不佳[5]。本次對(duì)29個(gè)X-SNP位點(diǎn)進(jìn)行150bp以下的文庫(kù)構(gòu)建，測(cè)序效果較好，且適用于降解檢材。檢測(cè)中可以對(duì)樣本進(jìn)行并行檢測(cè)，且可以根據(jù)樣本數(shù)量進(jìn)行不同容量芯片的選擇，最大程度上節(jié)約樣本。采用MPS技術(shù)對(duì)9個(gè)常用X-STR基因座進(jìn)行并行測(cè)序檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)A與B個(gè)體在9個(gè)基因座上檢見的相同等位基因具有相同的序列結(jié)構(gòu)，且測(cè)序序列上變異信息一致，進(jìn)一步增加了遺傳證據(jù)。

上述檢測(cè)實(shí)例為如何在常規(guī)X-STR基因座檢測(cè)發(fā)生突變情況時(shí)進(jìn)一步獲取遺傳證據(jù)提供了新的遺傳標(biāo)記及新的技術(shù)手段。其中MPS技術(shù)在多位點(diǎn)、多樣本的并行檢測(cè)中展現(xiàn)出了優(yōu)勢(shì)，為法醫(yī)學(xué)遺傳標(biāo)記的高效檢測(cè)提供了一種新的思路，為非常規(guī)親緣關(guān)系鑒定提供了新的技術(shù)手段。